国内外水产动物病理的研究概况综述

中国水产门户网报道
    水产动物病理学研究开始于20世纪50年代，它是一门研究疾病发生、发展中机体的形态、机能和代谢等方面的变化及其规律的科学。W．E．里贝林和G．三垣完成了第一部较完善的水产动物病理学著作《鱼类病理学》，对物理和化学的致病机理、肿瘤的病理学以及利用电镜对损伤细胞和亚细胞水平的观察等方面作了比较深入的研究[1]。此后随着水产养殖业的发展，水产动物病理学进入了系统研究阶段。研究领域也从淡水鱼类扩展到海水鱼类、甲壳类、软体动物、两栖类、爬行类、棘皮动物、哺乳动物以及观赏鱼等，研究手段已从显微组织病理深入到亚显微组织病理、组织化学、比较病理以及病理生理研究等。最近，随着其他学科如分子生物学及免疫学学科的渗入，一些相关的技术逐渐在病理学研究得到广泛应用。本文从水产动物病理学研究的对象，研究的方向，技术，诊断的方法等方面作一综述。 

　　1 研究的内容

　　1.1 研究的对象

　病理学研究的对象很广，从淡水鱼类到海水鱼类研究的都比较多。近年来，对名特优品种的研究也渐渐多了起来，对贝类病理的研究也比较多，如任素莲(2002)[2]报道一种牛首科吸虫幼虫在文蛤体内寄生所引起的组织病理学变化；李霞等(2000)[3]对被帕金虫孢子体感染的菲律宾蛤仔主要器官的组织病理学进行了观察等。从疾病上说，寄生虫引起的病理学研究也多了起来，只是真菌类疾病的研究相对来说少了一点。此外，因机械损伤、营养缺乏、环境因子等造成的病理研究更少，但国外做了一些工作。目前国内对人鱼共患疾病的病理研究还没有引起足够的重视，如张永嘉(1990)[4]报道的尼罗罗非鱼肝癌，在形态和生物学上与人类肝癌都有相似之处，但它们之间关系的研究还较少。国外研究较多的是鲑鱼类，大菱鲆等。新的鱼病还没有进行及时的研究，如在美国加利福尼亚鲑科鱼类身上发现的两种可能属于细小核糖核酸病毒引起的疾病，在苏格兰鲑鱼中发现的由液态沙雷菌、游菌引起的细菌病等[6]。国外对病理的研究较为系统，Conroy,-D.A. (1987)[7]等描述了不同的组织病理学和血液病理学，Amlacher,-E.(1992)[8]编著《鱼类病理学基本原理》，Roberts,-R.J(1979)[9]编著了《鱼类病理学》等。

　　1.2 研究的方向

　　1.2.1 血液病理学

　　研究的对象比较广，但内容都差不多。如李谷等(2000)[10]进行了转Bt－基因抗虫棉棉仁粉对鲤鱼的营养试验，在不同时期取血，测定血像、谷丙转氨酶、尿毒酶及血红细胞微核率等反映毒性效应的指标。陈福华等(1997)[11]研究了患病赤点石斑鱼的血液病理学。邢维贤等(1996)[12]从红细胞的形态，脆性和白细胞的比率以及血清电解质离子浓度和血清谷丙转氨酶等多方面对鲤鱼竖鳞病的血液病理改变进行了观察和研究。李义等(1998)[13]对大口鲶出血病的血液病理进行了研究。吴垠等(1998)[14]对患暴发性流行病的中国对虾进行了血液生理生化指标检测。张元柱等(2000)[15]分别测定了患穿孔病的中华鳖血液的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、球蛋白、钠、氯等10项指标，揭示了中华鳖穿孔病的血液病理变化规律。崔青曼等(1998)[16]对患有腐皮病的中华鳖的血液病理进行了初步研究。

　　1.2.2 生化病理学

　　吴惠仙等(2002)[17]研究了酯酶(EST)，过氧化物酶(POD)，乳酸脱氢酶(LDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶在日本沼虾中存在着组织和器官的特异性，患黑鳃病后酶带发生显著变化。蔡完其等(1996)[18]对罗氏沼虾莫格球拟酵母病的生化病理进行了研究，发现病虾肝脏超氧化物歧化酶活性显著降低，酯酯活性变异范围扩大。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，方廖琼等(1997)[19]研究了患细菌性败血症草鱼，曾伯平等(1995)[20]研究了患出血病草鱼肝脏、肾脏、心脏、锶及血清的乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）同工酶。邵健忠等(1993)[21]研究了三角帆蚌11种组织中16种同工酶系统的酶谱表型，组织分布，活性含量和迁移特征等。

　　1.2.3 组织病理学

　水产动物组织病理学是研究最多的内容，其中又以疾病引起的组织病理研究为多，本文不再叙述。

　　1.2.3.1药物中毒引起

　华可鼎(1995)[22]描述了氯霉素、呋喃西林等6种药物引起鳗鱼急性中毒的组织病理变化，发现其变化基本相似，只是程度不同。汪开毓等(2002)[23]研究了鲤鱼喹乙醇急性中毒的病理学。郭海山等(1990)[24]报道了硫酸铜慢性中毒能引起草鱼鳃小片毛细血管扩张，充血等。硫酸锌急性中毒引起白链和鲫鱼肝细胞坏死，解体等。Meinelt,-Th等(1997)[25]等研究了水体中汞引起的鱼组织病理变化。

　　1.2.3.4 机械损伤、营养缺乏、环境因子等引起

　刘忠等(2002)[26]研究了拉网、称重、装车、运输等应激反应，以及水温、溶氧等环境因子的突变引起的鱼的病理变化。席峰等(2001)[27]认为胁迫可引起如红细胞形态该变、吞噬细胞数量增加等一系列病理变化。王朝辉等(2001)[28]报道赤潮毒素引起鱼类鳃组织损伤的组织病理学。

　　国外在这方面研究的非常多，如Schreck报道随放养密度增大，银大麻哈鱼的白细胞比会降低。Chang等(1990)[29]发现新西兰发生的异弯藻赤潮引起鲑鱼鳃组织上皮细胞严重坏死。R. N. Morrison, B. F.等(2001)[30]等研究了大西洋鲑被给予左旋咪唑免疫增强剂或鳗弧菌疫苗后，负作用所引起的病理变化。J. W. Treasurer等(2000)[31]研究了不同水体养殖的大西洋鲑感染同一病原后引起病理的区别。Tacon,-A.G.J.等(1995)[32]研究了鱼类营养缺乏和中毒的形态病理学。

　　2 研究技术

　　2.1 传统的研究技术

　　病理学研究最普遍而又最可靠的方法，是以细胞学、组织学和组织化学的方法，对水产动物病变部位和健康机体的相同组织采用固定、切片，再经染色，显微镜观察等，了解机体组织的病变特点。刘建雄等(2002)[33]用该法研究并首次报道了黄鳝(缘拟扁蛭)水蛭病的病理。赵万鹏等(2001)[34]用此法研究了鳖肾脏的基本病理组织变化，并作了归纳、总结等。陈细法等(1996)[35]对电镜固定液进行了改良，并使用新的包埋剂制备超薄切片，在电镜下观察了感染ＭＢＶ的肝胰腺上皮细胞的超微病理变化。Roberts,-R.J等研究了斑节对虾黑鳃病的组织病理学。

　　2.2 染色

　　Lightner等(1993)发明了Giemsa染色涂片法用于对虾HPV的检测，只需2h，一台光学显微镜及少量器材即可用于现场检测。但郑天伦等（2002）[36]认为传统的H—E染色检测WSSV，较为费时。黄捷等(1995)[37]用T—E染色对WSSV进行现场检测，整个过程只需10min左右，操作简单易行，染色效果好于Giemsa染色涂片法。

　　2.3 显微镜观察

　　以前病理观察，主要采用光学显微镜。1966年美国开始建立诊断电镜实验技术以来，应用电镜观察标本细胞及细胞间的微细结构，并做出相应的病理诊断，从而使对发病机理的探讨及未分化肿瘤的确诊进入了亚细胞水平。此外，电镜已成为认识病毒形态结构，分类鉴别的有力工具。

　　黄灿华等(1997)[38]应用光镜和电镜技术比较研究了正常与发病中国对虾7种组织细胞的病理变化，为弄清对虾病毒引起的病症及致病机理打下基础。杜开和等(2002)[39]取患“白体病”罗氏沼虾腹部的病变组织及其鳃、心肌、肝胰腺、生殖腺等器官和组织，经光镜和电镜制样观察，未发现病原体。雷质文等(2002)[40]光镜和电镜下观察患白斑综合征病毒（WSSV）克氏原螯虾的组织切片。张建红等(1996)[41]描述了一种电镜诊断快速制样的方法在对虾病害检测中的应用，该法大大缩短了常规制样法所需时间。王文兴等(1998)[42]光镜和电镜下研究了胶州湾养殖海湾扇贝消化盲囊内寄生的原核生物。刘英杰等(2002)[43]用电镜在栉孔扇贝体内发现一种球形病毒。姜明等(1995)[44]年电镜检测了患病真鲷肠上皮组织，在细胞内发现了一种新的病毒粒子及其发生基质。徐润林等(1992)[45]在光镜水平下研究了刺激隐核虫寄生黄鳍鲷和真鲷后引起宿主组织病理学的变化。舒新华等(1999)[46]采用透射电镜对患腐皮病的牛蛙的病理形态的不同病期的病变皮肤进行了观察。Lee,-J.-S.等(2000)[47]用光镜和电镜对鲇鱼表皮和真皮系统的亚显微结构进行了研究。 

　　３ 诊断技术

　　诊断方法有有传统的形态病理学、扩增和生物测定、微生物学和血清学方法等。郑莲等(2001)[48]认为早期诊断必须具有较高的灵敏度，快速早期微量检测须借助于分子生物学技术及免疫学技术等，其中分子生物学技术集中在原位杂交及PCR技术上，免疫学技术主要有荧光免疫、酶联免疫吸附等。

　　3.1 生物测定法

　　生物测定与形态病理学检测方法一起成为传统的诊断法。如利用某些宿主对虾对病毒侵染易感的特点，将其作为指示虾，可对对虾病毒病进行检测。Bell等(1987)[49]用带病或有感病可能的对虾组织匀浆后的上清液注射到指示虾体内，观察反应。如果被检者带有病毒，则可传染指示虾，在实验2—3周将出现有关病症。据此可对待检样虾是否被病毒感染作出诊断。何建国等(1999)[50]利用生物检测，PCR、组织病理和电镜技术，发现消化道是斑节对虾感染白斑综合症杆病毒的主要途径。

　　3.２ DNA杂交

　　也叫原位杂交，研究始于1969年。此技术通过碱基配对，以一条DNA链为模板，在加入的单链DNA片段上加以标记(同位素、荧光素、酶、生物素等)作为探针，可检出具有与探针互补的DNA。60年代末，开始在组织切片上进行杂交。DNA杂交的深入研究，有助于灵敏度的提高，操作方便，开发试剂盒具有广阔前景。

　　自1992年对虾细小病毒IHHNV基因探针问世以来，这项技术一直被用于对虾病毒、立克次氏体状细菌和微孢子虫的诊断中。李新辉等(1997)[51]首先建立了鳜鱼病毒病的分子生物学检测技术，适用于对像鳜鱼一样还未能建立敏感细胞系的鱼类病毒病的研究，可以检测病毒在组织中的分布，对了解病毒在体内侵染组织、器官和扩散有一定意义。王吉桥等(2002)[52]对皮下及造血组织坏死病毒病(IHHNV)、桃拉症(Taura syndrome)、白斑综合症(WSSV)等病原均采用非放射性的基因组探针，目前已研制出了NHP、某些弧菌（Vibrio spp）和微孢子虫的传统基因探针。黄灿华等(1999)[53]通过原位杂交技术验证了感染对虾ＷＳＳＶ的淡水克氏螯虾和中华绒螯病体的组织病理与从中国对虾中分离的WSSV相似或相同。Mari,-J.等(1992)[54]克隆IHHNV基因做成探针进行诊断。Aoki,-T. (1991)[55]发展了快速DNA探针杂交的诊断方法。

　　3.3 聚合酶链反应(PCR)

　　PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。用PCR扩增靶DNA已经广泛应用于病害感染的检测，与传统的诊断方法相比，它具有灵敏性高、简单、快速等特点。

　　目前，PCR技术已广泛应用于对虾病原的诊断。战文斌等(2000)[56]研究采用Kimura引物，用PCR技术对不同生长期的中国对虾进行了WSSV的检测。Poulos B T. 等(1995) [57]克隆了MBV总长12.5kb的4条核酸片段，制作了4个核酸探针，使用效果较好，其中克隆了BMNV的2.2、2.5、3.0kb三片段，并制备了商品化的探针及PCR检测试剂。

　　3.４ 免疫技术

　　免疫学技术在病理学上的应用使水产动物病理学在近十几年中发生了突飞猛进的发展。应用较多的是荧光免疫法和酶联免疫法。此外，黄印尧等(2002)[58]对人工养殖九孔鲍暴发急性病，建立了病毒琼脂扩散诊断法。

　　3.4.1 血清学

　　血清学诊断已用于对虾病原的诊断。但目前只有血淋巴凝固时间和血球数量变化可用于虾病诊断。现已研制出几种弧菌和病毒的单克隆(Mab)和多克隆(Pab)抗体来诊断对虾病原，但还须解决ELISA中免疫球蛋白(IgM)Mab与正常组织成分的非特异性反应问题，以提高诊断的准确性。薛清刚等(1995)[59]用密度梯度离心纯化的HPV颗粒免疫家兔制备特异性抗原血清，建立了一种反向间接血凝法诊断HPV感染，敏感度达ng/ml病毒蛋白的检测水平。张吕平等(2000)[60]用光镜观察感染白斑杆状病毒（WSBV）的斑节对虾的血淋巴涂片，研究了血清的主要生化指标，首次提出了WSBV在宿主体内增殖的时间过程。法国以血清反应为基础，对病毒性传染的血清学进行了大量研究工作。丹麦针对病毒性出血性败血病进行了血清学研究，英国针对传染性胰脏坏死病进行了血清学研究。

　　3.4.2　荧光免疫

　　免疫荧光技术是利用荧光色素标记抗体与组织切片或细胞涂片中的相应抗原反应，结合形成抗原—标记抗体复合物，借助紫外光或蓝紫光激发荧光色素，在显微镜下呈现特异性荧光反应，从而定位抗原的技术。Hamaguchi,-M. 等(1988)[61]用荧光抗体技术检测了鲱鱼血细胞表面隔膜免疫球蛋白。Sano等(1985)将荧光抗体(Fluorescent Antibody)技术用于BMNV的诊断。国内使用荧光免疫技术研究病理罕有报道。

　　3.4.3 免疫组织化学

　　免疫组织化学技术是利用抗原抗体反应在微观世界原位地确定组织及细胞结构化学成分的，其特点是：定性可靠，定位准确，定量可能。

　　夏永娟等(2000)[62]首次探索利用免疫组织化学ABC法检测鳗弧菌，并用组织学Ｈ.Ｅ.染色技术对鳗弧菌人工感染后的牙鲆肝组织及胃肠道进行了组织病理学及细菌的定位研究。黄灿华利用胶体金免疫标记技术对感染病虾细胞质中出现的球状病毒作定位标记。薛清刚用兔抗对虾肝胰腺细小病毒IgG和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG建立免疫组织病理检测技术。Yoshimizu,-M等(1988)[63]用免疫组织ABC法和间接荧光免疫法检测了带菌大麻哈鱼的抗原。Ciuchini F等(1999)[64]等利用免疫组织化学技术对鳗弧菌感染后的小鼠和猪的各种组织进行了研究，取得了良好效果。

　　3.4.4 酶免疫法

　　酶免疫测定是指用酶标记抗原或抗体进行的抗原抗体反应，以底物被酶分解后的显色深浅来反映待测样品中的抗原或抗体含量。酶标法用普通显微镜即可观察，对石蜡切片和新鲜组织均适用，并且细胞结构洁晰，组织定位准确，敏感性和特异性都优于免疫荧光法。

　　黄捷等[37]，于佳等[65](1995)制备WSSV单克隆抗体，并用该抗体进行了间接ELISA检测，结果与对照组切片H—E染色结果较为一致，且能在发病前20—40d作出预报。

　　国外目前已经研究出了快速显示技术，大部分是酶免疫鉴定法ELISA。Nadala Ec等以病毒多克隆血清作一抗，应用Western blot检测对虾血淋巴和鳃中的病毒，该方法适用于亲虾带毒的检测。Lewis(1986)则运用酶联免疫法对对虾病毒进行了检测。Shankar,-K.M.等(1999)[66]用兔抗鲤科鱼类抗体，用ELISA检测了印度主要鲤科鱼类的抗原。Dixon,-P.F.等(1996)[67]用免疫学方法检测了彩虹鲷抗胰腺坏死病毒的抗体。

　　4 小结

　　近年来，在病理研究方面有了很大发展，已从显微组织病理深人到亚显微组织病理，组织化学、比较病理、以及肝肾等功能的病理生理研究等。截止1996年，已对40多种水产动物疾病的组织病理和10多种疾病的病理生理进行了研究[68]，查明了发病机理，从而为病理诊断和防治提供了理论依据。

　　综合国内外水产动物病害研究的进展状况，其总的趋势为：研究种类、范围越来越广，包括各类水产动物、各类病因(病毒、细菌、寄生虫、物理化学因素及营养性因素)；研究方法越来越先进、简便和精确；研究深度也越来越深，从表面现象到DNA的解析。（杭州市水产技术推广站，上海水产大学）
 
 


                                         编辑：邓洁