免疫技术在水产动物上应用的现状和前景

中国水产门户网报道
    免疫学是研究抗原性物质、机体免疫系统和免疫应答规律的一门生物科学。免疫学原理在水产领域方面应用较迟，国际上对鱼类免疫的研究始于20世纪30-40年代。我国对鱼类免疫研究起步较晚，始于1955年，进展较慢，近20年来，免疫学在理论和实践方面都取得了突飞猛进的发展，尤其近几年来，我国对养殖鱼类的免疫研究，取得了一些可喜成绩，并在生产上起到了增产的效果[1]。近几年的研究表明，免疫技术在水产动物上的免疫学诊断、疾病防治及营养免疫等多方面均有广阔的应用前景[2]。

　　1 免疫学诊断

　　免疫学诊断，目前常采用的方法有：血清中和试验、凝集反应、沉淀反应(琼脂扩散、免疫对流电泳等)、补体参与的反应、免疫标记检测方法(荧光免疫技术、酶免疫技术、放射免疫测定法)以及免疫电镜等。此外花环试验、移动抑制试验、巨噬细胞吞噬功能试验等体外细胞免疫测定法也曾用来进行鱼类免疫学诊断。沉淀反应、琼脂扩散、对流免疫电泳可靠、方便、特异性强，但灵敏度低[3]。

　　鱼类免疫学诊断已经显示出生命力，今后的主要任务是进一步完善和发展，使诊断试剂商品化，诊断程序标准化，诊断仪器简单化。在诊断中，不仅能够定性分析，而且能够定量分析，充分发挥它准确、快速的特点。

　　1.1 凝集反应
　　杨先乐等[4](1999)用间接红细胞凝集反应检测中华鳖（Trionyx sinensis）血清抗体，测得该法的灵敏度为13.41±4.2，并且证明该法具有较高的特异性、灵敏度、准确性和重复性。 
　　目前常用于快速检测水产动物细菌和病毒的方法是葡萄球菌A蛋白协同凝集试验(SPA—CoA)。马家好等[5](1999)应用此法为主要检测手段，诊断了淡水养殖鱼类主要细菌性传染病。杨广智等[6](1991)用此法检测出了草鱼出血病病毒。此法检测不仅快速、特异，而且设备简单，适用于基层单位检测草鱼出血病病毒，这对于草鱼出血病的正确诊断和防治以及病毒血清型的研究有着一定的意义。 

　　1.2荧光抗体法
　　荧光抗体技术是最早使用的免疫诊断技术之一，分直接法和间接法两种[2]。经过半个世纪的发展与完善，已广泛应用于水产养殖病害诊断。
　　余俊红等[7](2002)实验结果显示，应用间接荧光抗体技术不仅可以用于诊断发病的感染花鲈，也可用于检测带菌状态或未发病的感染花鲈。陈昌福等[8](1998)用直接荧光抗体法鉴定患细菌性败血症的斑鳢（Channa maculata）是由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)引起的。
　　此技术已用于许多鱼类疾病的诊断，尤其是在实验室里。常用来鉴定组织涂片的病原菌，也可用来鉴定分离的病原菌，简单易行，检测快速。现已成为现代免疫学研究中广泛应用的标记免疫检测方法之一[9]。但该技术需要一定的特殊仪器——荧光显微镜，在生产上使用受到一定地限制。

　　1.3 酶免疫技术
　　酶免疫技术的方法很多，其中又以酶联免疫吸附(ELISA)和 Dot-ELISA技术应用最为广泛[2]，已经在动植物病毒检测中得到越来越广泛的应用。
　　吴礼龙等[10]（1997）用间接ELISA测定草鱼出血病病的毒力及其免疫疫苗的效价，30min内出结果，其方法简单易行，速度快，反应的稳定性和灵敏度性高。朱建中等[11]（2002）也用间接ELISA检测人工感染WSSV的螯虾（Cambarus）组织样品中病毒，48h后即有阳性检出，而正常螯虾组织均呈阴性。邵健忠等[12]（1996）认为Dot-ELISA能检出草鱼出血病病毒（GCHV）的最低含量为3pg，且快速易行，是目前检测GCHV最为有效的方法，并可在草鱼出血病临床诊断和病毒疫苗质量鉴定等方面得到应用。
　　目前利用酶免疫技术的原理已制备出检测草鱼出血病、传染性胰腺坏死病、传染性造血组织坏死病的试剂盒。不仅具有操作简便，不需要特别仪器设备，灵敏度高，结果可定量等优点，而且能同时进行多样本检测，无论在实验室还是在养殖场，均具有推广价值。

　　1.4 胶体金技术
　　可大致分为液相和固相胶体金标记技术。
　　邱德全等[13]（1998）用胶体金建立斑点免疫检测方法，测定中华鳖对嗜水气单胞菌外毒素抗体效价。结果表明：该方法有高的特异。与血清中的其它成分交叉反应小，检测灵敏度达4ng，其灵敏度仅次于放射性免疫对蛋白质的检测方法。
　　姜新[14](1993)认为应用胶体金探针比酶联免疫吸附试验省略了底物显色的过程，试剂对人体无害，且在室温下即可较长期的保存，方法可靠、操作简便、快速、结果敏感、特异。
　　詹曦菁等[15](2001)还认为该技术不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记，使定位更加精确，特别是在光镜和电镜下的多重定位研究，有其它方法难以代替的优点[16]，近来胶体金核酸标记方法的应用更是开拓应用这一方法的新前景[12]。 

　　1.5 放射免疫技术
　　虽然其灵敏度高，但其放射性元素对人体和环境均造成危害，这限制了它的应用和发展。

　　1.6 单克隆抗体技术
　　单克隆抗体技术的应用，为鱼类免疫学诊断和血清试剂商品化生产创造了条件。与常规血清抗体相比，它具有特异性强，亲和性一致，能识别单一抗原决定簇，且容易制备等优点。
　　储卫华[17]（2000）用1B4和5E3两株腹水混合，建立Dot—ELISA检测HEC毒素，从病鱼分离的95份培养上清液中阳性率为76％，敏感性较同步应用的多抗常规血清高，为嗜水气单胞菌引起的败血症的诊断提供了有效的检测手段。D.V. Lightner 等[18](1998)认为单克隆抗体技术具有快速、简单、灵敏度高，价廉等优点，可用于检测IHHNV，HPV，WSSV等，但目前成功的报道还较少。J.M.coll [19](1995)等认为用单克隆抗体技术检测 IHNV目前的灵敏度还不够，但可以用于VHSV的检测，单克隆抗体技术目前多用于实验室，如果能在改进单克隆抗体制备方法等方面进行深入研究，其潜在的优势将得到充分地发挥。

　　1.7 PCR(聚合酶链式反应)技术
　　该技术最近也被用于水生动物疾病的诊断。方法非常灵敏，只需1mg病灶组织含有10个病原菌即可检测出来，对细菌性鱼病的诊断与防治有广阔的前景[2] 。陆承平等[20]选用气单胞菌的毒素基因中保守区的同源寡核苷酸序列为引物，用PCR技术检测临床分离的嗜水气单胞菌的毒素基因，获得了较满意的结果。

　　1.8 核酸杂交技术
　　随着分子生物学技术的发展，疾病的诊断技术已经进入基因组诊断的分子生物学水平。利用核酸探针进行的核酸杂交技术在近几年中已用于细菌性鱼病的诊断[2]。该技术将更多地应用于病毒性鱼病的诊断。

　　1.9 磁免PCR技术
　　目前处于研究阶段，在水产上应用不是很多，郑莲等[21](2000)也只是对弧菌检测作了些初步工作，取得较好效果。
　　但该技术有着显著的优点，对操作设备都无高的要求。在水产中除了对虾外其他的动植物都可以应用，无论是哪种病原也都可以采用。它对病原诊断具有重要的意义。

　　2 水产动物疾病防治

　　随着人们意识到化学药物治疗的许多不足，鱼用疫苗得到了广泛的运用，国外迄今已批准上市的鱼类疫苗达30种以上，这些疫苗的使用已取得了非常显著的效果。我国鱼用疫苗的研究起步较晚，但发展较快[１]。所用的疫苗主要是用新技术和新方法研制出的病毒疫苗、高效价疫苗等[2]。鱼类对疫苗抗原的免疫持续期较长，一般都达3-5个月。有的在1年以上，这为疫苗的应用创造了良好的条件。随着研究的深入，联苗、多价疫苗以及基因工程疫苗的应用，它们的防病效果将会大大超过化学药品等其它防治措施，从而提高经济效益。但是鱼用疫苗(特别是病毒病疫苗)尚还存在免疫效果不够稳定，成本较高，缺乏合理、有效、方便的给予途径和评价方法等问题，现阶段疫苗的制备及其在实际生产中的广泛应用仍存在着一定的困难。

　　２.１ 灭活疫苗
　　亦称死疫苗，这种疫苗的安全性好，制备容易，但存在免疫剂量较大、免疫持久性较差或免疫的效果不理想等问题。
　　王玉平等[22](2000)初步证明用对虾副粘病毒细胞培养灭活疫苗对日本对虾（Penaeus japonicus Bate）和中国对虾（Penaeru Chinensis）虾苗的浸泡免疫，可以达到预防该病的目的。刘德福等[23]（2002）采用草鱼病毒性出血病灭活疫苗对本场草鱼进行免疫注射，保护率达98％，有效的预防了本病的发生，取得满意的效果。李占魁等[24]（2002）对网箱养殖的草鱼注射灭活疫苗试验，其成活率均在90％以上，且比浸泡疫苗的疗效更显著。

　　2.2 活疫苗
　　目前在水产动物上使用的有3种类型：(1)弱毒疫苗，该类疫苗具有较好的免疫原性，且免疫剂量小，免疫持续期长，但安全性较差易出现强反应现象。如VHSV的F25(21)抗热株疫苗、CCV减毒疫苗、IHNV减毒疫苗等；（2）利用与病原体有交叉反应的异种抗原制成的疫苗。接种后能使机体对该疫苗中不含有的病原体产生抵抗力，该疫苗的优点是安全性好免疫持续性长，但获得较难。如防治小瓜虫病的梨形四膜虫疫苗；（3）将有致病力的病原菌作为疫苗。如草鱼出血病低温隐性感染疫苗在生产上取得了较好的免疫效果。但需用异常的给予方法或与血清同时应用。

　　2.3 亚单位疫苗
　　通过提取病毒的亚单位(如蛋白质衣壳等)制成疫苗。如CCV蛋白壳亚单位疫苗。其优点是可除去核酸、减少致癌作用和一些异常反应，避免抗原间的竞争，提高免疫效果。

　　2.4化学疫苗
　　用化学方法提取细菌的有效成分而制成。如鳗弧菌、斑点叉尾鮰肠道败血症(ESC)、类结节症、鲤鱼嗜水单胞菌及草鱼烂鳃病旧疫苗等。
该疫苗具有接种剂量小，反应小等特点，但制备技术复杂。

　　2.5 DNA疫苗
　 DNA疫苗是继减毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗和重组多肽疫苗之后的又一新型疫苗，比其它疫苗高效、安全又易于大量生产。目前在水产上应用的DNA疫苗有鲑、鳟鱼类的IHNV、IPNV、VHSV、杆状病毒(SVCV)、鲤春病毒(SHRV)、草鱼呼肠弧病毒(FRV)、文蛤病毒及鲑鱼疮痂鲺等DNA疫苗[25]。其中IHNV基因工程疫苗已获专利，最近已开始小批量生产[26]。
　　但是，DNA疫苗存在着缺陷，如研究周期较长，难以解决燃眉之急；免疫原成份单一，若遇到病原体微小变异，就有可能失去它的免疫保护作用；有些病毒基因工程疫苗还不能象完整病毒那样在动物体内产生足够量的抗体而起到免疫预防作用，目前采用肌肉注射的方法耗时费力，在实际生产中具有一定的局限性。同时找到抗感染的功能基因也存在很大的问题，石军等[25]（2002）认为目前由于对鱼类免疫系统的研究还不够深入，对于鱼用DNA疫苗的作用机制和鱼类各种病原体抗原基因的分离也有待于进一步的探索。开发针对主要致病性细菌的多联基因工程疫苗，将在生产中具有更广阔的应用前景。

　　2.6 合成肽疫苗
　 合成肽疫苗是用化学合成法人工合成病原微生物的保护性多肽并将其连接到大分子载体上，再加入佐剂制成的疫苗。具有制备容易、可大量生产、稳定、易保存、副反应少、价廉及使用安全等优点，因此Meloen RH[27-28](1997)认为合成肽疫苗是疫苗学的最终目标，非常适于传统疫苗所不能达到的特殊目的。
　合成肽疫苗近几年已得到发展，但还存在不少理论和实际上的障碍：①免疫原性弱，使用时必需配用佐剂或必需直接用表达菌的裂解产物；②不同肽免疫活性亦不同。研究表明，合成肽的抗原性不但与分子大小有关，还与空间构型、亲水性、肽类所带电荷有关。③部分肽只含激发B细胞的表位。

　　3 水产动物营养

　　目前对水生动物的免疫系统还未完全研究清楚，特别是水生无脊椎动物免疫机制的基础研究还比较落后，加上一些评价标准、检测指标难以确定、检测手段还落后等，这些制约着水生动物营养免疫学的发展[11]。同时目前研究主要集中在免疫增强剂和佐剂等添加后对免疫功能影响的研究，对深层次机制的研究不多，但水生动物营养免疫学还是取得了一些可喜的发展。研究证实，一些富含多糖、生物碱、有机酸等多种成分的天然免疫物质，蛋白质、氨基酸、高不饱和脂肪酸、维生素和矿物质等都对水生动物的免疫功能具有显著的影响[2]。

　　3.1 Vc
　石军等[29] (2002)许多研究表明，保证机体最佳免疫状态的vc需要量远大于机体最佳生长的需要量。当vC含量为100mg／kg饵料(最适生长需求量)时，不影响幼虹蹲抗体产生；当vc加入量为其最适生长量的5倍和10倍时，均能明显促进抗体的产生，并在10倍时产生最多(NavaDG等，1989)。这与在斑大西洋鲑(5dM*。胁)上的研究结果基本一致(WM曲等，1993)。
　　Vc通过提高水产动物免疫力来抵抗疾病的发生，因而从根本上避免了生产中由于抗生素等化学药物滥用所造成的耐药菌株不断增加，水产动物免疫功能下降，以及水产品中的药物残留等问题，因此必将得到更广泛地运用。

　　3.2 免疫多糖
　　其中，葡聚糖的免疫增强效果已得到广泛研究，尤其是酵母葡聚糖。现应用于水产动物中的有酵母葡聚糖，ß—1，3葡聚糖(VST)，肽聚糖几种类型。其中，b—1，3葡聚糖已被用来预防疾病。
　　朱旺明等[30](2000)研究表明在鳗鱼饲料中添加0.06％—0.1％葡聚糖，可使鳗鱼肠炎发病率降低30％-50％，同时也能刺激鳗鱼食欲，促进生长。酵母葡聚糖能提高鱼类的溶菌酶产量和巨噬细胞的杀菌活性。

　　3.3 左旋咪唑
左旋咪唑(LMS)是一种合成药物，不仅有免疫增强效果且能经口服，在水产动物中使用能提高抗病力，降低死亡率。吴志新等[31]（1998）对异育银鲫注射左旋咪唑(LMS)，明显促进鱼血液中白细胞的吞噬活性。但是使用不当会有毒副作用，因给予过量的关系，而出现免疫抑制作用。

　　3.1.4 EZO——(虾型)免疫促长剂
　　它是一种运用传统医学及现代生物工程从绿色植物中提取的纯天然活性物质。近年来在各地人工养殖海、淡水虾类中起着令人瞩目的效果，尤其在预防杆状病毒感染的肝胰脏白点病、烂鳃病及保肝护肝方面具有卓越之功能。
姜礼燔等[32]（2000）用含本剂饲料投喂南美白对虾，该地区虾的肝胰脏白点病及烂眼病几乎均未曾发生。
　　它具有效应高、效果快，抗病力甚强，用量少，成本低等优点，因此易于使用推广[32]，有广阔的应用前景。

　　此外，FK-565，EF203，弗氏完全佐剂(FCA)运用也比较多，其中FK-565被认为是到目前为止，已得到确认经口服有效的少数免疫激活剂之一[33]。Olav Vadstein[34](1997)认为今后研究的重点会放在人兽医已经研究透彻的免疫增强剂上。
　　免疫增强剂是通过作用于非特异性免疫因子来提高水产动物的抗病能力并减少抗生素等化学药物带来的负面影响，因此比化学药物的安全性高，比疫苗的应用范围广。另外，它和疫苗的混合使用还能增强疫苗的疗效。目前，通过多来源、多途径的方式开发研制低毒、高效、速效、长效的新型免疫增强剂已成为发展的主要趋势[35]。随着对它的使用方法、剂量和期限以及对水产动物免疫机制的研究进一步深入，免疫增强剂将会成为控制水产动物疾病，提高免疫力的有效途径。

　总之，虽然我国对水产动物的免疫研究起步晚，至今不足50年，但发展较快，已经取得了一些辉煌的成就。伴随着养殖品种规模化生产，免疫技术在水产上得到广泛的研究和应用。目前主要集中在水产脊椎动物的研究上，如对草鱼、青鱼、鲢、鳙鱼、鲤、鲫鱼、鳜鱼、鳝、甲鱼、乌龟、牛蛙、贝类、虾类等[36]，其中虾、蟹类免疫技术的研究和运用还不是很多，对水产动物营养免疫的研究还处在起始阶段。
　　但免疫技术在水产动物上的免疫诊断、疾病防治上意义重大，它可减少某些化学药物对水体的污染，有效预防大水面养殖鱼类流行病，并且克服了经常用药防治鱼病而对某些药物产生抗药性的弊病[37]；此外，通过人工免疫以及对发病后有免疫力鱼体的筛选，可培育免疫力强的品种和个体[38]。可以预见，免疫学在水产业中的应用将愈来愈受到高度重视，它必将为水产动物的免疫学诊断、疾病防治和营养免疫开辟更广阔的前景。
 
 


                                          编辑：邓洁