牡蛎基因组诠释生命的睿智

 

 

 

 

牡蛎复杂完善的细胞内应激防御系统。图片中的英文名词为基因专用名称。

 

 

9月19日，国际顶级学术刊物《自然》（Nature）杂志在线发表了基于多组学方法揭示的牡蛎对潮间带逆境适应分子机制及贝壳形成复杂性的研究成果。这是我国水产养殖研究成果首次以长篇论文（article）形式登上该刊物。据统计，论文发表当日在线点击和下载就达到了一万多次。论文发表两个月来，受到国内外的广泛关注和好评。

 

“牡蛎基因组研究在面向国家重大战略需求和重大科学前沿的结合上，做得非常好。研究成果的取得是一个很鼓舞人心的成绩！”著名科学家、中国科学院院士朱作言毫不掩饰赞许与欣喜，对《中国科学报》记者坦言，“无论是国内还是国际，相关领域的研究基础都非常薄弱，不像人类或者水稻基因组的研究那么多。项目面临的挑战是非常艰巨的，经过四年多的研究，能取得这样高水平成果，是一件很不容易的事。”

 

继水产养殖产业创造辉煌成就之后，中国在水产养殖基础研究方面再一次为世界所瞩目！

 

 

 

牡蛎是典型的海洋生物，也是潮间带的优势物种，对近海和海湾生态系统的稳定起到了重要调控作用。对海洋生物来说，潮间带是一种极端环境。营固着生活的牡蛎对这种极端环境的高耐受性在海洋动物中极为罕见。

 

牡蛎在地球上的出现时间远远早于人类，化石证据表明，至少2亿年来牡蛎外部形态没有发生改变，它们年复一年，兢兢业业地把海洋里的二氧化碳转变成碳酸钙形式的贝壳。牡蛎是最早被人类利用的海洋生物之一，目前已成为世界上产量最大的海水养殖动物。

 

牡蛎还是文化内涵最为丰富的贝类，在人类文明史上留下了深深的烙印，莎士比亚的“The world is my oyster”是脍炙人口的谚语。

 

近些年来，基因组学发展迅速，影响越来越大，几乎渗透生命科学的各个方面。中国科学院海洋研究所研究员张国范长期致力于海产动物遗传与育种研究，特别关注在变化的海洋环境条件下，牡蛎等海洋贝类性状的遗传基础和改良方法研究。他参加了由相建海研究员主持的中科院海洋功能基因组研究团队，一直在思考并努力尝试将基因组学应用于贝类遗传改良研究。2008年4月，当中国工程院院士李宁在国家“863”计划现代农业领域专家组会议上，提出“基因组育种是未来育种的主流发展方向”的观点时，张国范进一步坚定了研究牡蛎基因组和开展基因组育种的信心和决心。

 

“我认为研究不具现实操作性。……研究基础太薄弱。……需要投入的资金数目太大了，我们能做好吗？……”当时，国内完成基因组测序的只有水稻、家蚕等少数物种，团队成员出于对基因组研究领域的向往和陌生，表现出迎接挑战的既兴奋又忐忑的神情。然而，基于在贝类育种领域的多年实践，对贝类生物学知识的深厚积累及对现代生物学前沿领域的深刻认识，张国范认准了这个有很大发展潜力的研究方向，对研究计划相当坚定。

 

“最终会做好的！”他说，“只要努力做下去，必定能做出好成果来。”

 

随后，张国范邀请长期从事牡蛎基因组研究的美国Rutgers大学教授郭希明加盟，两人迅速对项目达成一致，确定了科学目标和整体研究思路。

 

2008年5月，张国范、郭希明联合深圳华大基因研究院和国际同仁，正式发起了国际牡蛎基因组计划（OGP）。项目得到了獐子岛集团股份有限公司的大力支持。

 

就此，我国水产养殖动物首个基因组研究计划开启了序幕。

 

 

 

高多态性和高重复序列是牡蛎基因组的重要特点，也是国际上对这类生物基因组研究望而却步的重要原因。作为非模式生物，它并没有近缘物种基因组信息可供参考，项目的艰巨性不言而喻。尤其是项目采用相对经济的第二代测序技术，尽管可获得海量的数据，但测出的碱基序列却都很短，这对后期的拼接组装是个严峻的考验。加之当时还没有成功的案例，一些专家以不同形式对项目的技术可行性提出了质疑。而早在2005年，美国科学家就曾组织过牡蛎基因组研究计划（OGC），但由于种种原因，计划被搁置。中国科学家领衔的牡蛎基因组计划能成功吗？

 

此时，在牡蛎基因组计划启动前，另外一组美国科学家已开始对另一种海产贝类——帽贝进行了基因组测序。究竟第一个贝类基因组会由哪个团队率先完成？

 

质疑没有让项目组失去信心，竞争无时无刻不激励着项目组成员。负责基因组多态性研究的亓海刚回忆：“我们每天醒来的第一件事就是收发邮件，交流前一天的研究进展。通过网络会议形式与国外专家开展学术沟通。大家几乎把所有的时间都放在基因组数据解析上，能一起在实验室附近餐馆吃一顿饭就算是最好的休息。”

 

在会议室，记者看到，几张简单的木板床就在里屋。贝壳形成机制方向的负责人王晓通说：“经常在这里集中办公，有时候工作到深夜，我们就睡在这里了。”

 

2010年7月31日，经过艰苦努力，项目组终于宣布绘制完成了世界上首张贝类全基因组序列精细图谱。

 

“这是新的起点。基因组序列图谱没有最好，只有更好，后续需要改进的还有很多。”张国范平静地说。

 

“2010年底，我们开始整理手头的研究数据，感觉研究成果足以整理两篇重量级论文，同时投到《自然》，但由于时间紧迫以及团队成员有限，我们最终采取了集中精力整理一篇顶级论文的策略。”李莉，这位年轻美丽且韧劲十足的女科学家自豪而又有些惋惜地说。

 

2010年底到2011年10月，课题组十余人进驻深圳华大基因研究院，进入了全面封闭的研究状态，无节假日休息，埋头整理实验数据和论文。以研究生身份作为主力队员“打满全场”的张琳琳仍然记得，十一长假，在炎热的深圳，空荡荡的办公楼里只有项目组成员在埋头苦干。张琳琳在牡蛎基因组研究中的孜孜以求也成就了她的一篇优秀博士学位论文。

 

终于，不负众望，经过4年多的辛勤努力，项目组最终完成了备受瞩目的研究成果。2012年9月19日《自然》杂志以长篇论文形式在线发表，10月4日纸质版刊印出版。

 

我国著名贝类学家、中国工程院院士张福绥指出：“这是国际贝类学研究的重大成果，提升了我国贝类及海洋和水产研究的学术水平，为贝类及其他水产动物的遗传改良奠定了重要的遗传学基础。”

 

 

经过两年多的努力，项目组于2010年下半年成功完成基因组精细图谱的拼接组装。

 

牡蛎基因组的高杂合性和高重复序列对拼接来说具有很大的挑战性。如果采用大熊猫等的全基因组鸟枪法策略，根本无法完成如此复杂的基因组项目。因为采用这样的方法，就会把高度杂合区域的同源序列当做基因组不同的位置都组装出来，而很多不同位置的高度相似的重复序列被误认为来自同一个位点。为此，项目组开发了基于fosmid pooling的多层次分级组装方法，很好地解决了这个问题。

 

牡蛎基因组测序使用的是一只在美国经过4代近交的被昵称为“丹尼斯”（Dennis）的牡蛎。首先，项目组把牡蛎基因组DNA打断成40 Kbp（千碱基对）左右的片段，每个片段插入一个fosmid载体并转染进细菌，这样每个菌群就携带牡蛎基因组的40 Kbp左右的一段DNA序列。一共构建了大约15万个这样的菌群，整个文库携带了大约5.8 Gbp（十亿碱基对）的DNA片段，相当于牡蛎基因组大小的十倍左右。如果在整个文库中随机挑选90个菌群，其携带的90个片段来自基因组同一个位点或者彼此是重复序列的几率会非常低，这样就可以解决高杂合和高重复序列对拼接造成的困难。把它们混合在一起测序并通过第一级组装获得DNA拼接序列，这样既降低测序成本，又能保证这90个片段的顺利拼接。随后，项目组一共测序并拼接了1600多个混池，获得了更多的拼接序列。将这些序列再进行第二级组装，获得超级重叠序列群。最后，利用大片段测序文库的信息，对这些组装序列进行定位和排序，最终获得了牡蛎基因组组装序列。有了这个良好的序列组装基础，就可以进一步深入了解牡蛎基因组结构特征，发现平均每43 bp的序列中就存在一个由SNP（单核苷酸多态性）或者InDel（插入—缺失）导致的变异，比大多数已有报道的物种都要高，其变异频率是人类等哺乳动物的10倍以上。此外，牡蛎基因组的重复序列含量也非常高，占到了基因组的36%，一些转座子仍然十分活跃。在此基础上，借助转录组、表达谱以及蛋白组等多组学技术，就可从多层次多视角对牡蛎各种生命活动，包括对逆境适应的分子机制进行精细解读。

 

 

项目组利用各分类阶元代表性物种共有的单拷贝基因，建立了分子进化树并估算各个分支之间的分化距离。研究发现两侧对称动物与辐射对称动物大约在6.9亿年前发生分化，而牡蛎与人的共同祖先大约在6.2亿年前开始分化。分化年代的估算结果支持生物物种大爆发是发生在早寒武纪之后一段时间的学术观点。

 

项目组对牡蛎不同发育时期、不同器官的样品进行了全基因组表达研究。从受精开始，每隔1个小时取样一次，对前24个小时的发育进行高密度发育谱分析。此后，每天取样一次，直到附着变态形成稚贝。一共获得了38个发育时期的基因表达信息。这些数据对解读不同基因的功能及其调控机制提供了重要参考以及庞大的数据基础。

 

项目组以进化发育生物学中受到广泛关注的HOX基因簇为例，对牡蛎的发育相关基因特点进行了分析。HOX基因是重要的发育基因，生物体的头尾、左右等体制形成主要由这一类基因决定，如果这类基因在人类中变异，会造成多指症等多种疾病。HOX基因簇包含大约10～15个成员，它们在染色体上的物理位置是依次排列的，在人类中以HOX1～HOX13命名其13个基因。由于脊椎动物经历了两次基因组复制，因此在人类中可以找到4条HOX基因簇。而牡蛎和其他无脊椎动物一样，只有一条HOX基因簇。且牡蛎HOX基因的排列顺序被其他基因插入而打断，造成这些HOX基因在发育过程中的表达时序也被打乱。而且牡蛎还缺失HOX基因簇中的Antp基因。这些变化造成了牡蛎什么样的生物学改变, 它的功能又是由哪些基因来补偿？一系列科学问题尚待进一步研究。

 

 

项目组把牡蛎基因组和人、海胆等7个物种的基因组进行比较，发现了8654个牡蛎特异的基因，这些基因可能在牡蛎或者贝类的进化中起到重要作用。有趣的是，通过功能注释发现这些基因的功能多与抗性防御相关。而通过人工检验，进一步对抗性相关基因进行细致研究，发现一些基因家族在牡蛎中的成员数量远远超过其他物种，这些基因的功能涉及到蛋白折叠，氧化和抗氧化，凋亡和免疫反应等。这些功能都是牡蛎抵抗逆境不可或缺的。比如热激蛋白70（HSP70）在生物抵抗高温等各种逆境中发挥着重要作用，研究人员在牡蛎基因组中鉴定出88个HSP 70基因，数量远远高于人类中的17个和海胆中的39个。

 

为了进一步调查这些帮助牡蛎抵抗严酷环境的基因是如何工作的，他们进一步设计实验，检测牡蛎对逆境胁迫的反应。通过检测牡蛎在不同温度、盐度、露空和重金属等60多个逆境条件下的基因表达情况，发现5800多个基因在至少一种应激下发生明显的表达变化，很多调控基因会在不同的逆境条件下被“征用”。同时还发现逆境条件下起作用的基因往往倾向于在基因组中存在其他拷贝，这意味着防御相关基因会复制自己从而随着进化不断增多，这可能对牡蛎适应复杂多变的潮间带生活意义重大。

 

牡蛎在潮间带生活，每天都要经历两次潮涨潮落，规律性地处在露空环境下。研究发现，牡蛎的凋亡抑制蛋白（IAP）基因数目不仅高度扩张，而且在长时间的露空后， 5个凋亡抑制蛋白的表达量上调了67倍，其他凋亡抑制因子也有相应的上调。除露空之外，这些凋亡抑制因子在高温和低盐条件下也有上调。这些现象充分表明牡蛎中存在着一个强有力的凋亡抑制基因网络，让牡蛎能够耐受露空等逆境胁迫。在露空条件下，牡蛎还会同时受到夏季高温或冬季冰冻带来的温度胁迫，项目组发现，牡蛎也进化出了精密的调控系统来应对这些挑战。牡蛎在受热刺激后，有5个HSP70家族的基因表达量上调了2000倍，约为该样本所有转录本数量总和的4.2%。这些基因和凋亡抑制因子一样，在牡蛎中既存在复制扩张又能够在受到温度刺激后大量上调，从而使其能够生活在温度可以高达近50℃、低温逾-20℃的潮间带环境。

 

 

牡蛎通过进化出复杂的基因调控系统来应对逆境的本领着实让人惊讶。其实，牡蛎第一个让人想到的防御措施并不是这些基因，而是那些质地坚硬、奇形怪状的贝壳。早在5亿多年前，贝壳便出现在远古地球生物中，那时背负着厚重的贝壳或许是生物界的“时尚宠儿”，当然贝壳也很实用，是一种很强大的防御装备。钙化的贝壳为贝类提供了很好的抵御捕食、干燥、雨淋等环境变化的物理屏障。而近些年愈来愈严重的海洋酸化将会干扰和破坏这道屏障的功能，影响贝类的生存，进而影响近海生态系统的稳定。贝类的贝壳主要由精巧的有机框架和无机成分构成，无机成分主要是文石和方解石，它们都是碳酸钙结晶。一般认为贝壳的有机框架由外套膜分泌的几丁质、丝蛋白和酸性蛋白构成，其中酸性蛋白控制碳酸钙晶体的结晶和生长。

 

项目组提取了牡蛎贝壳中总蛋白，测定了牡蛎贝壳蛋白谱，发现了至少259种蛋白存在于牡蛎贝壳中。令人惊奇的是，贝壳中发现了很多意想不到的蛋白，它们可能参与了贝壳基质框架的构建和修饰。重要的是，大部分贝壳蛋白是非分泌性蛋白，这与目前流行的贝壳是外套膜分泌形成的观点明显相悖，表明贝壳的生物矿化机制远比目前人们的认识要复杂得多。经过分析认为，贝壳基质和细胞外基质可能存在一定的相似性，一些在细胞外基质中存在的特征蛋白在外套膜中高度表达，并在贝壳中出现。与在细胞外基质中一样，血细胞可能也在贝壳基质中参与了纤连蛋白样纤维的组装。

 

项目组还在外壳蛋白中发现众多具有细胞基本代谢功能的蛋白质，其中包含不少外来体蛋白，这从分子层面表明，细胞和外来体可能参与了外壳的形成。著名的酪氨酸酶竟然也在贝壳中被发现了，一般来讲，酪氨酸酶与黑色素的形成有关，但研究中发现大多数的酪氨酸酶基因在不生成黑色素的外套膜内侧表达量更高，说明贝壳中的酪氨酸酶还有其他功能，也许酪氨酸的氧化与交联对于贝壳基质框架的形成具有重要意义。

 

总之，不但外套膜分泌的丝蛋白和多种其他蛋白参与了牡蛎贝壳有机框架的形成，而且很可能还有血淋巴细胞和外来体蛋白也参与了该框架的构建。研究表明，贝壳中存在大量的生命活动，其复杂性远远超过人们的既往认识。

 

 

一个研究成果的诞生离不开团队，更离不开团队身后的各种有力支持。

 

牡蛎基因组项目瞄准海洋和水产领域的关键科学和技术问题，具有前瞻性、创新性和重要的现实意义，是一个系统的科学工程，任务重、困难多、投入大。研究过程中，项目组得到了中国科学院、科技部、国家自然科学基金委、农业部、山东省和獐子岛集团的大力支持，是政企研合作的又一杰作。

 

研究之初，项目组面临诸多问题，首要就是经费。当时，水产领域基因组研究计划尚未启动，在极需经费支撑的时候，獐子岛集团董事长吴厚刚的一句话令张国范悬着的心放了下来，“你就干吧，费用由獐子岛负责”。正是这笔一周内就拨付到位的巨额经费，保证了项目顺利、及时启动和实施。

 

吴厚刚对记者表示，集团深刻认识到科技对产业发展的巨大推动作用和基因资源对产业可持续发展的重要性。重资支持牡蛎基因组的研究，是从国家需求、产业发展的高度，从自身战略发展的角度作出的重要决定。集团对牡蛎基因组计划的后续研究与未来的产品研发充满了信心。

 

2009年下半年，国家“863”计划开始支持包括水产养殖在内的农业基因组研究，后又启动了国家贝类“973”计划项目。国家经费的及时到位进一步保障了项目研究深度和广度的拓展。

 

项目首席科学家张国范表示，牡蛎基因组研究成果能在国际顶级学术刊物上发表，是团队成员共同努力和各方面支持的结果。得益于建立了一支集国内外优势力量的研究团队，得益于有国家龙头企业和国家科技部门的有力支撑，得益于有诸多同行专家学者的鼎力支持，得益于有中国科学院良好的科研环境，更得益于中国改革开放30多年经济社会的快速发展。当然，也得益于他们选择了一个为学界瞩目的科学问题，而研究的对象既具典型性，又是国际面孔。

 

在取得该项为国际瞩目的重要成果的同时，更重要的是还涌现出一批积极进取、能攻坚克难的学界青年翘楚。正是由于有这样一批青年科学家的勤奋与智慧，才使牡蛎基因组项目的成果异彩纷呈，耀眼夺目。

 

项目的另一位首席科学家郭希明是美国Rutgers大学教授，曾入选中科院“百人计划”，获“国家杰出青年基金”支持，是中科院海洋功能基因组海外团队成员，为该成果的取得作出重要贡献。郭希明说：“项目组建立的牡蛎基因组数据库，包含了大量的基因组和转录组信息，为国际海洋生物学、比较基因组学和贝类水产基因组育种研究提供了坚实的基础。”

 

华大基因的青年科学家方晓东、罗瑞邦等人总能在出现技术瓶颈的时候提出有创新性的解决方案，而“大总管”王俊更是把牡蛎项目列为最高优先级进行重点关注，并在具体工作中给予诸多中肯指导。

 

项目得到美国、英国、克罗地亚和德国众多科学家的合作支持，他们以各自领域的专业知识，为基因组数据的分析和解析作出了重要贡献；同时，也得到国内众多科学家的关心和帮助，充分体现了中国科技界的齐心协作精神。

 

正是聚集了这些支持与帮助，汇八方之力，协同创新，牡蛎基因组项目进展快速。

 

 

 

2011年11月，《自然》杂志资深编辑M. Skipper博士来访中国，第一时间关注到牡蛎基因组成果。2011年12月，项目组以预投稿的形式将论文提交给编辑部，并于2012年1月30日正式投稿。

 

据介绍，《自然》每周能收到200余篇投稿，其中四分之三以上都被直接婉拒，只有8%的论文最终能发表，其中以长文形式发表的仅有3～5篇。

 

就在审稿过程中，2012年2月，日本学者关于珍珠贝基因组测序的一篇论文公开发表，成为世界上第一个关于贝类基因组的报道，使得项目组措手不及。然而，该基因组拼接效果较差，且缺少有意义的生物学解析，未引起《自然》等刊物关注。

 

牡蛎基因组论文的审稿过程可谓漫长而艰难。作为共同第一作者的许飞还记得这长达几个月的过程，三位审稿人一致认可论文的重要性和研究高度，但在第一轮就提出近60个问题。每次应对评审意见，对项目组成员都是一场新的战斗，而大家总是战斗到截止时间的最后一刻。事实上，这种修改也使论文有了新的提高。实验室的门卫依稀记得在凌晨六点论文修改稿提交之后大家兴奋而疲劳的神情。在合作者们的共同努力下，经过三轮修改，稿件最终说服了三位审稿人。

 

邮件中，审稿专家写道：“这是一项大工程，工作的完整性令人难以置信，将会成为基因组研究的标杆。祝贺这个团队！赶快发表，不要再拖了。”

 

牡蛎基因组的高质量拼接效果及其对科学问题的深刻阐述，最终得到这个国际顶级学术刊物的青睐！

 

成果发表后，得到了世界上相关领域科学家的高度关注。相关媒体如英国BBC news，美国《华盛顿邮报》、《科学美国人》、《科学日报》，“美国国家广播电台”等在第一时间进行了报道。来自英国、美国、巴西、西班牙等国家的媒体记者纷纷给项目组首席科学家发来采访要求。《华盛顿邮报》说这是“第一个被充分测序的贝类基因组”。 一时间，贝类、牡蛎、基因组等关键词成为科技新闻媒体的热点。美国的一个贝类学实验室第一时间在其网站主页上添加了牡蛎基因组数据的链接地址，并且感慨“终于成为现实！”

 

据记者了解，牡蛎基因组计划发布的数据量之大，涉及面之广，是除了线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等少数几个模式物种之外少见的，为研究和利用海洋生物基因资源提供了重要基础。首先是促进牡蛎或贝类的分子育种进入基因组育种时代。科学家通过研究大量的生长发育、生殖性控和抗逆抗病等重要性状的相关基因功能，对其遗传改良奠定基础。其次是促进海洋生物抗性免疫生物学研究的发展，对重要病原与宿主的相互关系研究，将进一步揭示病毒的感染、复制、调控机理、阻断病毒感染和设计抗病药物等，为研制疫苗、抗体和新型药物提供技术平台。第三，通过大量的基因数据可以筛选和发现海洋生物特有活性物质，开发具有自主知识产权的海洋药物、功能基因产品、新材料等。如牡蛎固着相关的物质在牙科、仿生制造等行业都具有很好的应用前景。第四，一些基因产物可以开发为环境监测产品，用于生态监测、生态修复等。

 

“牡蛎基因组序列精细图谱的绘制完成仅仅是个开始，在探索海洋生物对逆境适应进化机制和发掘海洋基因资源的万里长征中，我们只是迈出了比较坚实的一小步。”张国范表示，下一步将抓紧对功能基因进行深度验证，全面解析牡蛎典型性状，开展基因组育种、基因产品开发和生物新材料等应用研究，提升我国海洋和水产生物基因资源研发水平，促进海洋和水产养殖产业健康和可持续发展。

 

朱作言强调：“牡蛎基因组作为中国水产养殖成果的代表，搭建了高水平的研究平台，是很鼓舞人心的，但不能仅停留于此并津津乐道，而是要继续往前走。只要坚持下去，水产科学基础研究一定能做得更好。”