对虾肠孢子虫细微结构和系统发育关系的研究

    原文题目：对虾肠孢子虫（微孢子目：肠上皮微孢子虫科），斑节对虾（十足目：对虾科）的一种新型寄生虫：细微结构及系统发育关系

                                                作者来自泰国 

特别鸣谢中国水产论坛网友“南海渔医”提供文献线索，感谢利洋水产医院提供精准的翻译工作！

       摘要： 本文介绍了一个寄生于斑节对虾肝胰腺的新型微孢子虫种，对虾肠孢子虫。描述了这种寄生虫的不同阶段，从早期的孢原细胞到寄生于宿主细胞质中的成熟孢子。这种多核孢原细胞表面包含无数的小泡，直接存在于宿主的细胞质内，在早期发育过程中，孢原细胞的核进行二次分裂，在孢原细胞内形成无数的预成孢子。而电子致密环和极管前端是优先于在合孢体表面的早期孢子细胞萌芽在合孢体的细胞质中发育形成的。成熟的孢子呈椭圆形，测量为0.7 *1.1μm，包含一个细胞核，5-6圈极丝，一个后位空泡，一个锚盘附在极丝上，和一个厚的电子致密壁，这个壁是由质膜构成的，一相对薄的电子透亮的孢子内壁（10nm）和电子致密的孢子外壁（2nm），DNA引物设计源于微孢子虫的SSU rRNA基因，片段扩增为848 bp（GenBank登录号FJ496356），测序产物与拜氏微孢子虫的SSU rRNA具有84％的同一性 ，即基于肠孢子虫家族独特的超微结构特征，合孢体的细胞质位置和SSU rRNA序列与拜氏微孢子虫有16%不同，这种寄生虫被定为一种新的物种，即对虾肠孢子虫，属于肠上皮微孢子虫属。

简介：
       自2003年起，泰国斑节对虾的养殖一直受生长缓慢综合征（MSGS）的影响，土池养殖中，受MSGS影响的虾与未受影响的虾相比生长率大幅度下降，损失堪比白斑病毒病（WSSV）。虽然通过组织病理学，透射电子显微镜（TEM），聚合酶链反应等方法可以在几种器官中观察到多种传染性病原体，但是MSGS的病因尚未完全阐明。更为显著的是，可以在淋巴器官中观察到多个球状体，表明包含了几种已知或未知形态的病毒。病虾的肝胰腺细胞中有时也可观察到对虾杆状病毒（MBV），肝胰腺细小病毒（HPV）的包涵体，也可能是到目前为止没有鉴定出的微孢子虫。
       微孢子虫是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫，一般在宿主细胞中通过核扩散形成孢子来进行发育，而且某些属在宿主细胞核质内进行相似的发育，也有报道称微孢子虫有些属会感染甲壳动物，包括八孢虫，微粒子虫，小孢子虫，匹里虫，单极虫，Flabelliforma，格留虫, Vavraia, Ordospora, Nadelspora 和 Enterospora.据报导，各种甲壳动物的组织和器官已经被感染，例如：帕沙瑞帕斯和弗莱格尔报道对虾八孢虫感染南美白对虾和斑节对虾的肌肉和结缔组织；灿宁等人报道单极虫感染棕虾和白虾的肌肉。发病机制使虾的整个肌肉和腹节发展为多发性病变，导致虾出现“棉花尾”症状，对虾的肌肉组织受微孢子虫感染也见报道。
       少数微孢子虫只感染甲壳动物肝胰腺小管的上皮细胞，斯腾福德等人发表的刊物中描述了两种欧洲蟹被微孢子虫感染，这种微孢子虫由于合孢体细胞核的位置被归类到微孢子门的肠上皮细胞微孢子虫科，同时也是基于孢子的挤压结构先质的形成（如极丝、锚盘），还有这种寄生虫的合孢子（即成为独立成熟孢子之前）内形成的其它细胞器。这一发现是证明肠上皮细胞微孢子虫在甲壳动物体内的另一个典型代表。
       这种新型细胞质微孢子虫只感染受生长缓慢综合症（MSGS）影响的的斑节对虾的肝胰腺小管上皮细胞，发生率较高，正好提供了一个研究其发展和分类的机会。重点是对这种寄生虫组织病理学和超微结构功能的研究，也包括对它SSU rRNA基因的一部分与数据库中其它微孢子虫的序列进行比较分析。 

 

图一   斑节对虾肝胰腺小管的上皮细胞中的对虾肠孢虫显微照片


（A）肝胰腺组织H＆E-染色涂片显示出大量的微孢子虫孢子（箭头所示）。
（B）梯度分离液提取的微孢子虫孢子。
（C和D）肝胰腺组织切片显示肝胰腺小管上皮细胞质中的嗜酸性的粒状包涵体（箭头所示）。
（E）肝胰腺组织半薄切片显示在小管上皮细胞质内早期和晚期的合孢体（插图a）以及成熟孢子（插图b），一些孢子没有显示出染色点代表他们凹面的一端。A，苏木染色； C，三色染色； D，H＆E染色； E，甲苯胺蓝染色。
     ePM：合孢体早期；lPM：合孢体后期




图二  对虾肠孢虫在斑节对虾肝胰腺小管上皮细胞发育的早期阶段透射电子显微照片

（A）有两个核的早期合孢体阶段。
（B）多核的早期合孢体阶段。
（C）在宿主细胞内一组合孢体被一个液泡包围，表明出现了核分裂（插图中箭头所示）
     MV：微绒毛；V：液泡 

 



图三   斑节对虾肝胰腺小管上皮细胞中对虾肠孢虫孢原细胞阶段的透射电子显微照片

（A）早期含核的孢原细胞，清晰的囊泡（插图a,箭头所示）,极丝前型（插图a,箭头所示；插图b）。
（B）孢原细胞边缘位置的孢子原生质（星号所示）。
（C）孢原细胞外围的几个预成孢子（星号所示）。
（D）原生质膜呈现出微绒毛状结构被宿主细胞质（箭头所示）中大量的粗面内质网（箭头所示）所包围。
（E）合孢体加厚的质膜在与宿主细胞质的接口处显示出囊状结构。
（F）晚期孢原细胞显示已发育好预成孢子、极丝和极帽。

讨论
       这是第一份关于微孢子虫超微结构特征和完全感染斑节对虾肝胰腺小管上皮细胞的部分SSU rRNA基因序列的报道，其独特的结构特征与肠上皮微孢子虫家族相关联，基于它不同于微孢子虫家族中Nucleospora属和Enterospora属，而相似于肠上皮细胞微孢子虫属的单一物种，所以我们把感染斑节对虾的新型微孢子虫归类到肠上皮细胞微孢子虫属。我们认为它在无脊椎宿主上的发生率以及与拜氏微孢子虫SSU rRNA序列的同一性相对较低都可以证明它是本属中的一个新物种。
       对虾肠孢虫这一新物种的命名只是基于符合肠上皮细胞微孢子虫整个家族独特特征的超微结构特点，而不是区别于这个家族的其它种类，例如拜氏微孢子虫也是在宿主细胞的细胞质中发育， Enterospora属和Nucleospora属的一些种是在宿主细胞的细胞核内发育。区别出Enterospora属和Nucleospora属很明显的是根据细胞核的发育而不是细胞质的发育，然而，区分出拜氏微孢子虫并不是一开始那么清晰。
       对虾肠孢虫与肠上皮细胞微孢子虫属唯一的成员——拜氏微孢子虫有几点相像之处，这两个物种的孢原细胞都位于宿主细胞的细胞质中，并在孢子挤压装置和成孢子细胞萌芽形成之前形成初期形态；这两个物种的孢子细胞都被释放到宿主细胞的细胞质中接着直接发育成卵圆形的孢子。其它类似的形态特征包括每个孢子都含有后位空泡和5~7圈的极丝排成两列。但是对虾肠孢虫的平均孢子大小（在新鲜制剂中1.1 *0.7μm）比拜氏孢子虫（1.5* 0.5–1.0μm）小一点，两个物种区别不是很大，有争议说两种生物不足以命名为两个不同的物种。
       因为被拜氏孢子虫感染的脊椎动物中只有单核生物被报道，所以可以推测其它的生命周期阶段，比如微孢子形式和配子，可能发生在一个交替寄主体内，虾可以构成一个这样的宿主。然而，实际上在斑节对虾中的孢子也同样是单核的，并且他们的发育更类似于拜氏孢子虫，而不是反对这种可能性的从微孢子或减数分裂的核发育。此外，在人类传染病中关于拜氏孢子虫来源的研究认为可能与鸟类和哺乳动物的关系比虾密切，并且是淡水源而不是海水。所有的信息更偏向于赞成对虾肠孢虫不同于拜氏孢子虫的观点。
       两者的rRNA基因小亚基片段之间存在16%的差别可以认为其不同于其他种属的一个依据。一般来说在确定同种属的时候，基因相似性要达到97%，因此基因相似性在84%的范围的就会被认为是独立的新种。事实上N. salmonis和拜氏孢子虫在种属上有着85%的差别，这可能表明对虾微孢子虫应该是寄生在斑节对虾中的一个新的种属。因此我们建议建立一个新的种类在肠上皮微孢子虫属而不是保守的认为其是一个新的属。
       在系统发育树上来看，也许单个基因达到848bp没有足够目标基因的覆盖比例而使组成的系统发育树达不到足够的数据量。尽管有这样的警告，我们的微孢子虫系统发育树与其他数据库之间的联系是与以前出现的很多报道相似的。无论如何，我们完全基于本地区的初步分析表明，对虾肠孢虫与在其他水生动物宿主身上发现的微孢子虫是相似的。这种有趣的关系可能随着时间的推移而对更多的基因信息方面的研究有所帮助。
       对于之前描述的来自于蟹寄主的肠上皮细胞微孢子虫家族其他成员来说，对虾肠孢虫没有可用的遗传信息。然而，他们与对虾肠孢虫大大的不同是他们在宿主的细胞核内发育，而不在细胞质中。此外，对虾肠孢虫感染肝胰腺小管上皮细胞的所有形态的细胞除了F-细胞而Enterospora  canceri 感染所有形态的细胞除了B-细胞。
       唯一对泰国对虾其它孢子虫的描述就是对虾八孢虫，导致肌肉和结缔组织感染，原生质中的核为四倍体，通过孢子生殖变成单倍体的核。此外，A penaei与对虾肠孢虫SSU rRNA序列只有71％的相似度，显然他们只是远亲。
       微孢子虫中的几个种类能直接在宿主细胞细胞质中繁殖，而不在液泡中。然而脑炎微孢子虫和格留虫有一个寄生泡，在宿主细胞的细胞质中的早期感染阶段起到防止被破坏的作用。发现对虾肠孢虫有些合孢体有液泡而有些则没有。然而，这些小泡和类似微绒毛的结构存在于厚的膜内周围是没有液泡的合孢体，这可能是因为开始时合孢体在液泡中作为一个微小结构，直到合孢体膜扩展到一定区域与液泡膜直接接触形成一个厚的双膜结构。如果是这样，由于缺乏完整的细胞膜，可能观察到小泡和类似微绒毛的结构。类似一个薄的，无固定形态的电子致密层，也在感染褐虾肌肉的微孢子虫Vavraia mediterranica合孢体膜的外表面发现。不幸的是，没有合适的rRNA基因序列适合这个物种。
       在围绕着对虾肠孢虫的宿主细胞质中发现丰富的粗面内质网和线粒体，但不在虫体的细胞质内，这对于微孢子虫是正常的。现在很多人认为他们在他们的真菌界内可以构成一个单独的门，并且可以作为通过适应他们的细胞内寄生的生活方式而失去线粒体及其他细胞器的简约型代表。这不仅可以用基因序列的同源性分析证明，而且与单核生物（微孢子虫）和双核生物（真菌）的减数分裂周期具有类似的步骤。
       在我们研究中对虾肠孢虫的感染主要发生在几种病毒或是淋巴器官及造血组织的病原体感染中。在正常的小虾中感染的相对不是那么频繁。因此在自然界中宿主的免疫系统被病原体破坏而微孢子虫感染就有可能发生了，例如,人类和哺乳动物中出现的十二指肠和回肠肠上皮细胞感染的AIDS患者就是源于慢性免疫抑制所致。 

 

图四  对虾肠孢虫在斑节对虾肝小管上皮细胞中的透射电子显微镜照片

（A）孢子细胞在孢原细胞核外围，早期为空泡状（星号所示），有五个不成熟表面有细丝的部分（箭头所示），还有一个浓密的帽子形的锚盘结构（箭头所示）。
（B）后期包子细胞表面有成熟的极丝（箭头所示）
N：细胞核；PV： 后空泡 

 



图五 对虾肠孢虫的孢子发育周期透射电子显微镜照片

（A）表面覆盖着合胞体膜的未成熟孢子（箭头所示）。
（B）未成熟孢子图示：锚盘（AD），极丝（PF），极质体（PO）包括薄层状的部分（LPO）。
（C）成熟孢子下面锚盘的横切面展示了极丝（PF）的交叉面被薄层状极胞体（LPO）包围，和极胞体外极丝的纵切面。
（D）成熟孢子显示了极丝缠绕部分的截面。C和D具有相同的比例尺。