包埋光合细菌净化观赏鱼养殖污水的研究

      目前，家庭养殖观赏鱼已成为一种时尚，但是观赏鱼养殖中存在需频繁换水、不间断充氧等问题，给人们养殖观赏鱼造成了不便，同时还要消耗能源，增加家庭经济负担。我生物科研组在2001年培养光合细菌处理有机废水试验的研究过程中，发现光合细菌在厌氧的条件下生长良好，它不仅能显著地降解水中的有机物，还能增加水中的溶解氧。虽然光合细菌在观赏鱼养殖中已被生产应用，但使用的都是液态光合细菌，存在着散发腥臭味的缺点。同时，在养殖观赏鱼类的水族箱中，经常设有水循环过滤装置，游离光合细菌随着循环水的流动，部分的菌体被滤出，这样导致光合细菌在净化观赏鱼养殖污水方面，出现时效短等问题。

      为了解决这些问题，我查阅了相关资料，据有关资料报道，活细胞经包埋后可以增殖，形成的表面生物膜可自动更替，不必再经常培养和投放光合细菌，从而降低了养殖成本。为此，我尝试着用包埋光合细菌的方法，对观赏鱼养殖污水的净化进行更深入的研究。试验结果表明：光合细菌能净化水质，提高鱼类成活率。

　　光合细菌(Photosynthetic Bacteria，PSB)是一类具有光能生物合成体的原核生物，广泛分布于江河、湖泊、海洋等水域环境中，尤其在有机物污染的积水处数量较多。光合细菌利用光能进行光合作用，其光合作用仅限于缺氧条件下进行。根据有关文献报道光合细菌在污水净化、改善植物营养和增进土壤肥效等方面具有重要作用，其细胞富含蛋白质和B族维生素，可以用于制药，禽畜饲料和鱼虾饲料等。本实验采用红螺菌(Rhodospirillum sp．)，以各种有机物作为供氢体和主要碳源，作为光能异养(光能有机营养型，photoheterotroph)细菌。

　　采用光合细菌与海藻酸钠溶液混合，通过针头滴CaCl2溶液，形成凝胶状包埋颗粒。海藻酸钠在遇酸后可水解生成海藻酸(胶)。而更被广泛应用的是在可溶性盐的水溶液中加二价金属离子(通常是Ｃa2+)后在GG(双古罗糖酸)单元中形成金属配合物，即蛋格结合。

　　这种由二价金属离子“交联”形成的物质以较稳定的凝胶形式存在，具有很好的生物相容性和生物粘连性(粘膜靶向)，凝胶制备方法温和，现在被广泛地应用于药物和生物活性物质的载体。这样PSB通过扩散作用逐渐释放，自动更替菌膜。

　　光合细菌经过包埋后，观赏鱼的粪便以及饲料残渣粘附在包埋颗粒的表面。不但增加了沉降性，提高了观赏鱼养殖污水的净化效果，而且包埋的光合细菌因其厌氧的生物学特性，包埋剂又为PSB提供养料，增殖形成的表面生物膜可以自动更替，故又提高了它的作用时效。

　　一、实验方法

　　1．包埋试剂配置方法

　　将3．5克的海藻酸钠加入烧杯中，注入lOOml蒸馏水，用酒精灯加热并用玻棒不断搅拌。煮至沸腾，使海藻酸钠完全溶解，使溶液成为胶体。冷却后即可使用，如果暂时不用，应该保存于冰箱中。

　　２．固定试剂配置方法

　　将硼酸固体加入蒸馏水中，用玻棒不断搅拌直至不再溶解，每升中再加入2．5g氯化钙。盛于大烧杯中备用。

　　3．细菌的浓缩

　　在待测细菌培养液中先取出少量的样品用于菌体浓度计数。然后将溶液用离心机以3000rpm的速率离心5min，去除上层清液，下层的固体即为经过浓缩的细菌。

　　4．细菌的包埋与固定

　　将经过浓缩的细菌加入准备好的海藻酸钠溶胶中，搅拌均匀。用注射器吸取一定量上述混合物，装上针头，逐滴地把注射器中的混合物滴到固定剂中。液滴一旦遇到固定剂将立即凝固成为凝胶状的圆形小颗粒。固定需要经过24h才能完成。固定完成后就可以将这些颗粒取出，盛放在清水中，并贮藏于冰箱备用。

　　5．细菌浓度计数方法

　　把待测的细菌溶液稀释10倍(如果较浓，酎情稀释更大的倍数)，将稀释后的溶液滴于血球计数板上。加盖盖玻片后进行镜检然后计算出细菌浓度。

　　6．固定细菌的计算方法

　　分别取10ml、20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml浓度为1.22×109个／ml的光合细菌离心，再用对应体积的包埋剂进行包埋。

　　7．水质理化特性测定

　　(1)氨氮(Ammonia—N，NH3一N)测定方法：纳氏试剂分光光度法。

　　(2)溶解氧(Dissolved Oxygen，DO)测定方法：碘量法。

　　(3)化学需氧量(Chemical Oxygen De-mand，COD)测定方法：酸性高锰酸钾法。

　　二、对光合细菌进行包埋的可行性试验

　　我在应用游离光合细菌处理有机污水试验的研究过程中，观察游离光合细菌对养殖污水处理的效果，发现水族箱的绿藻生长很快。据我分析的原因是：光合细菌厌氧，而水产养殖的鱼类是需要氧，在养殖水体中有大量的氧，不利于游离光合细菌的生长，造成光合细菌容易死亡，使水中的有机营养物增多，促进了绿藻的繁殖，水体中溶解氧降低。过量绿藻的繁殖和观赏鱼争夺氧气，影响鱼类的生长。尤其是应用在家庭水族箱养鱼方面，浮游的光合细菌分散于水体，大量死亡，处理污水的有效时间也相应缩短。为了解决这些问题，我考虑应用包埋(固定化)技术的方法。

　　包埋(固定化)技术，就是把细菌经过浓缩以后，加入包埋剂中。待包埋剂凝固后，细菌就被固定下来。这种方法应该比较适用于像光合细菌这样的厌氧细菌。原因：一是包埋剂阻隔了细菌与外部的氧气接触(但不阻碍处理污水)，使细菌能够保持活力；二是包埋光合细菌颗粒状沉在水族箱水体的底层，当鱼类的排泄物和饲料残渣沉入水体底层时，更充分发挥包埋光合细菌分解作用的效能。

　　为了证明包埋细菌对养殖水质处理的优越性，我做了以下的实验：

　　将40ml浓度相同的光合细菌溶液加入100ml营养液中，置于锥形瓶中培养(此后不再添加营养液)。其中一瓶用胶塞密封并用凡士林封口。另外一瓶则用纱布扎紧，留有空隙。每天对其颜色进行记录。

　　与氧气隔绝的光合细菌尽管前十六天的生长速度不如有氧的光合细菌好。十六天以后，有氧状态下的光合细菌停止生长并趋于死亡，但是与氧气隔绝的一组依然生长正常。由于光合细菌的菌体与氧气隔绝，可以延长污水处理的有效期。

　　三、水质分析实验

　　实验一：游离光合细菌对养殖锦鲤水质处理的实验

　　准备九个鱼缸，分别加入自来水，静置三天后测定其原始水质，并调节至65升，编号为0—8号。0号为对照组，其余缸中依次加入1.22×109个／ml的光合细菌溶液10、20、30、40、50、60、70、80ml，每一个鱼缸再加入10尾锦鲤。每天每缸投喂0．3克饲料，饲养并观察15天后测定水质，30天后再测定一次水质，记录数据进行比较。

　　在游离的光合细菌净化养殖锦鲤污水的过程中得出以下结论：

　　(1)15天以内有好的净化效果，15天以后净化能力下降，这与光合细菌厌氧生长及被锦鲤吞食有关；超过30ml的投放量，水体出现腥臭味。

　　(2)30天内，COD、DO、NH3一N在5～8号缸的变化比较接近，在同等条件下养殖锦鲤，光合细菌的有效投放量为50ml×1.22×109个／ml。超过50ml的投放量，水体出现轻微红色。

　　实验二：包埋光合细菌对养殖锦鲤水质处理的实验

　　准备六个鱼缸，分别加入自来水，静置三天后测定其原始水质，并调节至65升，编号为0—8号。0号为对照组，其余缸中依次加入相当于1.22×109个／ml的光合细菌溶液10、20、30、40、50、60、70、80ml的包埋光合细菌，每一个鱼缸再加入10尾锦鲤。每天每缸投喂0．3克饲料，饲养并观察15天后测定水质，30天后再测定一次水质，记录数据进行比较。

　　在包埋的光合细菌净化养殖锦鲤污水的过程中得出以下结论：

　(1)30天内有好的净化效果，原因是采取包埋的处理之后，包埋剂使菌体与外界氧气隔绝，满足其厌氧的生理特性以及避免了锦鲤的吞食。鱼粪便粘附在包埋光合细菌颗粒表面，沉降在鱼缸底部，无腥臭味。

　　(2)有效投放量为70ml×1.22×109个／ml。

　　包埋剂会造成二次污染吗?为了验证包埋剂不会对生态环境造成二次污染，我小组做了以下的实验。

　　实验三：包埋剂对环境影响的实验

　　将处理完污水的细菌包埋颗粒埋入植物旁的土壤中，并且测定土壤pH值。经过30天以后挖开观察，测定pH值，并记录植物的生长情况。

　经过30天以后，包埋剂已经基本上被土壤中的微生物分解。pH值无明显变化。植物生长正常。证明使用包埋剂并不会对环境产生二次污染。

　　四、结果与讨论

　　通过实验观察发现，游离的光合细菌在静水的条件下，净化观赏鱼养殖污水时效约为15天。15天以后，水体开始有绿藻出现。而包埋光合细菌净化污水时效为30天 (或更长)。在包埋颗粒表面形成的生物膜可自动更替。这些生物膜更有利于提高光合细菌的分解性能，使光合细菌净化污水的能力大大提高。原因是：光合细菌是厌氧菌，包埋后更有利于其生长和繁殖，因此，增加了净化污水的能力和作用时效。

　　在65L水族箱中投放10尾锦鲤体长为：6．5—8．0cm，全长为：9．0～11cm，体重为：30—40g。加入相当于70ml浓度为1.22×10 9个／ml的包埋光合细菌时，净化养殖污水的效果最好。

　　从实验测定DO、COD、NH3一N等数据的指标来进行比较，发现包埋的光合细菌可以长时间有效地净化养殖污水。包埋光合细菌与游离光合细菌观赏鱼养殖效果相比较。养殖水体清晰度高，鱼体颜色鲜艳，鱼的活力增强。

　　通过对处理观赏鱼养殖污水后的包埋光合细菌进行二次污染实验，30天后土壤pH值变化不大，包埋剂颗粒已被土壤微生物分解，不会对环境造成二次污染。

　　实验证明：包埋光合细菌，解决了光合细菌个体小无法自然下沉的问题。光合细菌自然沉在水体底层，鱼的排泄物和食物的残渣粘附在包埋光合细菌颗粒的表面，便于光合细菌分解水体中的有机物质，保持养殖观赏鱼水质的稳定性，同时降低了家庭养殖观赏鱼的成本。

　　将光合细菌与其他细菌组合使用，净化效果可能会更好。进一步探讨用不同浓度钙盐溶液包埋光合细菌，其对净化养殖污水效果的影响。