对虾白斑综合症病毒检测技术概述

中国水产门户网报道对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus，wssv）病是全世界范围内对养殖对虾危害最大的病毒病。迄今为止，学者们对引起该病的病毒命名尚不统一，有白斑杆状病毒（WhiteSpotBac-ulovirus，WSBV）、皮下及造血组织坏死病杆状病毒（HepodermalandHematopoietieNecroisisBacu-lovirus，HHNBV）、日本对虾杆状病毒（Rod-shapednuclearVirusofPenacusJaponicus，RV-PJ）和系统外胚层和中胚层杆状病毒（SystemicEc- todermal and Mesoderrnal Baculovirus，SEMBV）等。所有这些病毒均被认为属于杆状病毒科的无包涵体杆状病毒亚群。在第六次国际病毒分类会议 （ICTV）报告中取消了以上命名，具体命名待定，按照Lightener的意见将其暂时命名为白斑综合症病毒（wssv）。我国自1993年暴发此病以来，每年都发生对虾大规模毁灭性死亡，几乎所有养殖虾类皆可被其感染。WSSV毒力较强，3～10天内被浸染者的累积死亡率达100.0%。世界动物卫生组织（OIE）2000年将其列为“需要作报告的疾病之一”。鉴于WSSV尚未有有效的治疗方法，快速准确的病原分离检测技术已成为研究的焦点之一。本文就对虾白斑综合症病毒（wssv）的检测技术作一综述，以供。 

    1 直接观察法  


    直接观察法是根据养殖过程中对虾急性和慢性死亡的情况，对照白斑综合症的典型症状作出判断。如头胸甲出现白斑、甲壳变软易剥离等，这种方法主要是根据实践经验判断，且必须是对虾感染病毒致死后才能发现。 

    2 组织化学法与电子显微镜技术 

    组织化学法是取对虾的各种组织用适当的染色技术在光镜下进行检测。主要有H-E染色和T-E染色等。莫照兰等（2000）曾用H-E染色感染 WSSV病毒的螯虾的鳃和胃组织，在光镜下观察病变组织与对照组呈现差异显著，组织结构松散残缺呈坏死状态。黄傻等首创一种用于现场诊断的T-E染色方法，整个检测过程只需要10分钟左右，具有快捷、简单、方便等优点，但是，这种方法对操作技术要求高，而且由于对虾可能终生带毒而不发病，因此，即使检测到病毒也不能确认一定会发病。相对而言电子显微镜观察更为准确，可直接观察到病毒的形态和大小。吴友吕等（1995）曾用电镜在对虾体内检测到WSSV。姜明等（1996）对中国对虾在病害暴发期间病虾肝胰脏、鳃、肾和肠组织进行固定切片，在透射电镜虾观察到杆状病毒的3种存在形态。莫照兰等（2002）对螯虾人工感染WSSV病毒并取鳃和胃用固定液固定，制成超薄切片在电镜下观察到WSSV的病毒粒子。谢数涛等（2000）纯化WSSV病毒并负染后在电镜下观察发现病毒的精细结构。Nunan等（1998）和Zhan等（1998）也曾对对虾人工感染WSSV进行了电子显微镜观察。组织化学与电子显微镜技术都是在病毒大量增殖后才能观察到，当感染早期或处于潜伏期病毒量小时，则难以观察到。 

    3 免疫学检测技术 

    免疫学检测技术是根据抗原抗体反应建立的，方法多种多样，主要用于快速鉴定。单克隆抗体和多克隆抗体的制备是进行检测的必需工作。单克隆抗体技术是随着杂交瘤细胞建立而发展起来的，可以产生对特异决定簇的特异抗体。优点是制备抗体时抗原不需高度纯化、特异性强；缺点是制备繁琐、试验条件严格、易漏检。多克隆抗体来源于抗血清，含所有抗原决定簇的抗体，易发生交叉反应，出现假阳性，特异性不强，一般不用于对虾病毒的检测。 

    对虾病毒的检测一般采用单克隆抗体，常用酶联免疫吸附分析（EIJSA）实验。酶联免疫吸附分析是目前发展最快的免疫标记技术，具有灵敏、快速、易操作、可定量等优点，应用广泛。于佳等（1995）将 WSSV病毒注射小鼠，用免疫后的脾细胞与Sp2/O骨髓瘤细胞融合，筛选出了可用于WSSV检测的单克隆抗体。黄倢等（1995）用单克隆ELISA技术提前20～40天对对虾发病的可能性做出预报。涂小林等（1995）用纯化的对虾病毒免疫新西兰兔获得多克隆抗体，建立了病毒的间接ELlSA检测技术，可在6小时内完成对样品的检测，灵敏度可达60ng水平。史成银等（1999）认为以脱脂奶粉作封闭剂的快速间接ELISA方法具有大大缩短检测时间，提高检测灵敏度降低或消除酶标板“边缘效应”、降低检测成本等优点，在对虾病毒检测的实验室研究和生产实践上都具有广泛的应用前景。汪岷等（2000）用纯化的WSSV免疫新西兰兔获得纯化的IgG多克隆抗体，建立了双抗体夹心法直接ELISA检测方法，6小时左右即可完成检测。朱建中等（2002）建立了WSSV单抗介导间接ELISA，不仅能快速检测病毒，还可用于检测WSSV在对虾动物模型体内的动态分布，为研究WSSV在螯虾体内的感染机理提供了手段。高宏等（2002）利用病毒细胞与宿主细胞亲和吸附这一特性建立了新的筛选中和抗体的方法，可在缺少细胞系的情况下成功筛选中和抗体。 

    Ponlos等（1994）制备了对虾WSSV病毒的 IgM型单克隆抗体，检测新鲜对虾时存在非特异性反应，需将新鲜样品冻存较长一段时间才能消除非特异性反应。Lightner等（1998）用WSSV单克隆抗体进行ELISA检测对虾时也出现上述问题。Hameed等（1998）用硝化纤维素酶免疫印迹法（NC-EIB）检测WSSV感染斑节对虾，发现在对虾淋巴、眼柄、鳃、头部软组织、腹肌和肝胰脏都存在WSSV。Zhan等（1999）制备了WSSV的单克隆抗体在中国对虾体内检测到了WSSV。 

    4 分子生物学技术 

    4.1 核酸探针（DNAProbe）技术 

    核酸探针技术又名基因探针或核酸分子杂交技术，其原理是两条不同来源的核酸链如果具有互补的碱基序列就能够特异结合成为分子杂交链。因此，在已知的DNA片段上加上可识别的标记，成为探针来检测未知样品中是否具有与已知序列相同的序列，并判断其与已知序列的同源程度。核酸探针具有敏感性高（可测出10E-9～10E-12的核酸）、特异性强等优点，易成功地用于多种疾病的诊断。在对虾 WSSV病毒的检测上，张岩等（1995）用Pub18构建了对虾WSSV的DNA重组质粒，提取后经斑点杂交和酶切分析，证明质粒中插入的片段为病毒DNA。刘萍等（1995）从纯化的病毒中提取DNA，用限制性内切酶酶切并组装到Puc18质粒上，建立了WSSVDNA文库，从中筛选出3个重组质粒，用光敏生物标记成探针检测染毒对虾效果很好。石正丽等（1998）从中国对虾病虾中分离到一种杆状病毒，在重组质粒中取2个克隆与WSSV基因片段制成探针检测我国沿海地区中国对虾杆状病毒的同源性。邓敏等（2000）通过分离纯化WSSV部分基因组文库，将制备的探针进行Southern杂交、打点杂交和原位杂交，结果证明克隆片段对WSSV特异，可用于WSSV检测。常青山等（2000）从中国对虾杆状病毒核酸随机文库中筛选出4个片段用地高辛标记作为探针进行斑点杂交检测对虾杆状病毒，实验表明中国对虾杆状病毒存在垂直传播的可能性。Lo等在检测野生斑节对虾WSSV时也发现该病毒存在垂直传播的可能性。黄灿华等（2000）首先用地高辛标记的WSSV核酸探针动态研究其在对虾体内的侵染过程，对虾摄取感染WSSV的食物，经消化道上皮细胞进入虾体，伴随淋巴循环进而侵染其它靶组织，直至对虾发病死亡。吕玲等（2000）用WSSV核酸探针原位杂交（1SH）检测对虾，发现对虾的不同组织对病毒具有特异性，并比较了ISH与H-E两种检测方法，结果ISH比H-E染色更准确、敏感。朱建中等（2001）用核酸探针斑点杂交方法研究了WSSV青岛株在螯虾体内的动态分布，表明病毒在对虾和螯虾体内感染机理具有相似性。Lo等（1999）、Chang等用此技术检测WSSV，但不是用PCR扩增基因片段得到核酸探针的。Nunan等和徐洪涛等以从感染对虾中纯化的WSSV为模板进行PCR扩增，然后用DIG标记扩增产物而得到探针。 

    雷质文等（2001）用PCR成功制备了DIG标记探针，用于检测对虾WSSV，证实了白对虾时WSSV的天然宿主。该法比常规方法快速，特异性、敏感性和可重复性均较高，可作为对虾暴发病的诊断、抗特定病原对虾的选育、出入境对虾及对虾产品的检疫方法，目前已制备成试剂盒。宋晓玲等（2001）用DNA斑点杂交检测对虾及其饲料和环境生物，发现对虾主要饵料及环境生物类群均可检出WSSV，为了解对虾WSSV的感染途径提供了依据。莫照兰等（2002）用地高辛标记的核酸探针检测WSSV人工感染的淡水克氏原螯虾，结果表明对虾WSSV克感染淡水克氏原螯虾，病毒核酸原位杂交检测敏感特异。 

    4.2 PCR技术 

    聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种可在体内将特异性DNA序列进行高效扩增的技术，与传统诊断方法相比，它具有敏感性及特异性高，简单、快速等优点，已广泛应用于 WSSV的检测。汪岷等（1998）用台湾WSSV的引物，对中国对虾杆状病毒进行PCR检测，结果表明中国对虾杆状病毒与台湾WSSV的同源性达98.7%，该PCR引物可用于对虾杆状病毒的检测。刘萍等（1999）采用PCR检测方法对人工感染亲虾的胃、鳃、卵巢、卵和各期幼体进行跟踪检测，认为WSSV难以从卵直接向幼体进行传播。战文斌等 （2000）通过PCR技术检测中国对虾WSSV，认为存在由亲虾传播给虾苗的感染途径。 

    （2000）应用PCR技术分别对暴发性流行病发生前、中、后期的对虾样品进行检测，结果表明PCR可快速灵敏准确的检测WSSV、对病毒的早期诊断和健康对虾的选育提供依据。谢数涛等（2000）通过对WSSV基因测序设计PCR引物，建立了对虾WSSV的PCR检测方法。上海生化所已研制成中国对虾杆状病毒 PCR诊断试剂盒，灵敏度达0.125ng，在上海、浙江等地应用时具有特异性。 

    为使检测结果更快速更准确，一些学者对PCR技术做了不同改进。吕玲等（2000）用改进的煮沸法提取WSSV病毒DNA，再进行PCR扩增，节省了检测时间（仅需4小时）且敏感性更高特异性更强，并认为附肢和肌肉是PCR检测的合适部位。章晓波等（2000）将对虾WSSV的一段特异性DNA设计成分子信标探针，用于该病毒的PCR检测，结果显示分子信标不影响PCR扩增且具有较高的特异性。夏春等（2000）根据对虾WSSV基因序列设计了4个多重PCR法用引物，建立了多重PCR检测WSSV的方法，通过优化反应条件，可从阳性感染的中国对虾fg级DNA中定性检测WSSV。谢数涛等（2001）利用套式PCR检测对虾WSSV，结果显示其灵敏度大约为一步PCR的10E4倍。庞耀珊等（2003）设计了一对WSSV的特异性引物，建立了快速检测WSSV的二温式PCR，最低可检测到1.0pg的WSSV总DNA，该PCR具有高度特异性和敏感性，可用于WSSV感染初期或潜伏期的亲虾和虾苗的检测和环境监测。 
     
    综上所述，对虾WSSV的检测技术从最初依靠组织病理学和透射电镜观察到免疫学方法、DNA杂交和PCR技术，灵敏度、特异性和重复性都有了很大提高，检测结果更加快速准确。一般PCR比DNA杂交，荧光标记比酶联免疫标记灵敏，由于条件限制，PCR常用于实验室操作，荧光免疫需特殊仪器，因此DNA杂交和酶联免疫应用较多。为了提高检测的灵敏度，弥补单一检测方法的不足，可采用多种方法结合使用。如制备DNA探针时，利用PCR扩增使探针量增加，DNA杂交与ELISA结合使用，再用酶标记探针的方法，PCR技术与DNA杂交结合使用，用DNA杂交检测PCR产生的结果，荧光标记用于PCR产物的检测，使结果更直观。总之，随着检测方法的不断改进，对虾WSSV的检测将更快速、简便、灵敏、特异。