虾白斑综合征病毒的研究进展

于力^1，2，李庆章¹

(1．东北农业大学动物医学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

兽医生物技术国家重点实验室／大动物病研究室，黑龙江哈尔滨 150001)

    对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是引起对虾白斑综合征(Wh ite spot syndrome，WSS)的病原。该病一旦流行，对虾在2～7天内的死亡率可达100％，国际兽疫局(OIE)、联合国粮农组织(FAO)以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)早在1995年就将其列为需要报告的重要的水生动物病毒性疫病之一。上世纪90年代初，该病首先在台湾地区发生，到1994年已扩展到全亚洲的对虾养殖地区。1995年11月该病毒在西半球被发现，1999年到达美国中部和南部，2001年出现在欧洲和澳洲。短短10年间，对虾白斑综合征席卷全球，给世界对虾养殖业造成了不可估量的损失。高密度的对虾养殖模式、日益恶化的饲养环境以及频繁的世界性贸易，都加剧了该病的发生与传播。由于宿主范围广泛，WSSV不仅给对虾养殖造成严重的损失，也给海洋生态平衡带来一定的威胁。本文以前面的系统总结为基础，对近几年WSSV的研究进展进行补充，特别强调WSSV复制方面的研究进展。

 

 

    自发现该病毒以来，研究者根据所分离病毒株的地域分布、原始宿主、形态发生以及感染虾的临床病理学表现，曾给予不同分离株以不同的命名，主要包括：皮下与造血组织坏死病毒(HHNBV)， 日本对虾杆状细胞核病毒(PVPD)，系统性外胚层和中胚层杆状病毒(SEMBV)，以及白斑杆状病毒(WSBV)。1991年国际分类委员会(ICTV)第5次报告，将WSSV归为杆状病毒科(Baculoviridae)无包涵体杆状病毒属(Non-Occluded Baculovirus)。随后对此病毒的基因进行同源性分析显示，它属于真核生物的一个分支，但与杆状病毒并非源于共同祖先，当时推测WSSV或是杆状病毒的一个新属，或是一个全新的病毒，但在1995年第6次ICTV报告中，该病毒被逐出杆状病毒科。1996年，Lighmer等建议将这类杆状病毒统一命名为虾白斑综合征病毒(WSSV)，这一命名得到国际虾类病毒研究者的普遍认可，并且延用至今。2001年，Hulten建议把该病毒划为Nimaviridae病毒科一个称作Whispovirus的新属，目前它是该病毒属的唯一成员。

 

 

    来自不同地域不同宿主的WSSV形态结构十分相似，完整病毒粒子的横切面为圆形，纵切面为杆状略带椭圆，外被双层结构的囊膜，囊膜内可见杆状的核衣壳，核衣壳内为致密的髓核。病毒的衣壳结构为螺旋圆柱体，大小约

为95nm×450nm，螺旋带几乎与衣壳长轴垂直，螺距为30nm，每匝螺旋宽26 nm，螺旋间距4 nm，该衣壳螺旋由两条平行的宽约9nm的螺旋和一条宽约8nm 的中间带组成。WSSV主要由蛋白质和DNA组成，目前认为不含有糖类(糖蛋白)和脂类。从日本对虾分离的WSSV，用1ppm NaC10处理30min失活，用5ppm NaC10处理10min失活，用10ppm有机碘(Povidone．iodine)处理30 min失活。在4℃海水中WSSV 至少存活120d， 在25℃海水中WSSV存活60d～120d；在4℃低盐度海水中WSSV只能存活10d，在25℃低盐度海水中WSSV能存活7d，而在28℃低盐度海水中WSSV只能存活5d。WSSV经uv(剂量：9×10 uW ·s／cm²)照射60min完全失活，经55℃处理90min和70℃ 处理5min完全失活，在pH1和pH12环境中10min失活，经臭氧(有效浓度：0．5µg／mL)处理10min失活，经100mg／mL NaCl0和有机碘以及75 mg／mL四级胺处理10 min失活。可见，射线、化学试剂、酸碱度(pH)、温度、盐度、和水中的游离氧对WSSV的感染活性均有影响。

 

 

脊尾白虾、南美白对虾、斑节对虾、日本对虾、墨吉对虾、东方白虾、长毛对虾、中国对虾、印度对虾、桃红对虾、蓝对虾、褐对虾、周氏新对虾、日本樱虾、近缘新对虾、长臂虾、刀额新对虾、虾蛄、毛虾等均可被WSSV感染。其中，前12种虾隶属于对虾科对虾属，可见对虾科对虾属的对虾比其他属的对虾对WSSV更易感。天津厚蟹、日本大眼蟹、乳斑虎头蟹等蟹类皆可被WSSV侵染，但尚无种属易感性差异的证据。此外，从浮游生物和糠虾等其他甲壳动物中也可检出WSSV。可见，海水甲壳动物对WSSV普遍易感，而且，感染的海洋甲壳动物是WSS的主要传染源。

在对虾养殖区，WSS可经对虾的饲养和加工暴露给环境。用浸泡方法感染对虾，可使之患病死亡， 由此推测，WSS疫区的海水以及对虾加工场排出的污染废水，均可以海水为媒介传播病毒。携带病毒苗种的引入、携带病毒水产品的交换和贸易、病毒污染的运输设备、以及货船外附着感染病毒的甲壳动物等，均属于贸易媒介性质的暴露，这是WSSV传播的另一个重要途径。在雄虾生精小管外围的结缔组织检出WSSV侵染，在卵巢的滤泡细胞、卵原细胞以及初级卵母组织也检出WSSV侵染，这些证据提示，WSSV也可能经垂直途径传播。

在自然条件下，WSSV突破对虾的第一道防线进入体内，往往处于潜伏状态，此时病毒携带虾的行为和体表特征均正常；在一定的环境因素协迫下，处于潜伏状态的病毒就会被“激活”，引起对虾发生疾病。WSSV从潜伏到激活的“开关” 尚不清楚，这不但是一个重要的理论问题，对于指导对虾WSS防治也具有重要的实用价值。

 

 

WSSV基因组为双链环状DNA分子，呈螺旋状，其全基因组序列已被测定。已有3个版本的WSSV全序列在GenBank公布，它们分别由来自荷兰、中国厦门和中国台湾的研究小组独立完成。由荷兰完成的WSSV全基因组序列(GeneBank accession No．AF369029)，其病毒（WSSV-TH)分离自泰国的日本对虾(Penaeus monodon)，序列测定采用螯虾(Procambarus clarkia)作为WSSV感染宿主进行，序列全长292 967bp，根据开放阅读框(ORF)序列重叠最少的原则，选出184个ORF，占全基因组的92％。由中国厦门海洋三所完成的WSSV全基因组序列(GenBank accession No．AF332 093)，其病毒(WSSV-CN)分离自日本对虾(Penaeus japonicus)，测得序列全长305 107 bp，分析有181个ORF，比荷兰测定的全序列多出12kb。国立台湾大学测定的WSSV(WSSV-Tw)全基因组序列(GenBank accession No：AF440 57O)，全长为307 287 bp。WSSV基因组有9个同源重复区(Homology region，Hr)散布于基因组，每个同源区由数个250 bp重复单位串联而成，已知杆状病毒也有同样的重复序列，但重复单位的长度为70 bp左右。在WSSV的ORF中，2％具有真核生物翻译起始的Kozak序列，46％有TATA box，54％有Poly(A)尾。已鉴定的编码VP28、VP26、VP24和VP19的ORF，只有VP19和VP15编码基因具有TATA盒，由此看来，TATA盒并非WSSV基因转录所必须。

WSSV的形态结构虽然与杆状病毒相似，但两者之间不存在序列同源性。在杆状病毒，有50％的ORF可在GenBank中找到基因同源物，而WSSV只有6％的基因在GenBank中找出了同源物。用DNA聚合酶进行的系统发育树分析表明，WSSV是一个与已知病毒没有任何同源性的病毒，它代表一个新的病毒家族。将WSSV基因全序列与基因库中的其它WSSV序列进行比较发现，大部分序列表现出高度的同源性，例如将来自中国对虾、越南斑节对虾和台湾对虾的WSSV序列进行比较，发现这些不同来源的WSSV序列存在高达98％～100％的同源性。Hulten等对WSSV基因组内的ORF进行同源性比较分析，将该病毒的ORF分为10个基因家族，各家族基因至少有的40％同源性，推测它们可能由基因复制而产生。基因家族1包括3个ORF(ORF1，ORF32和ORF153)，它们分别编码病毒的结构蛋白VP28、VP26和VP24；基因家族2包括两个ORF(ORF2和ORF61)，推测其编码产物为蛋白激酶 ；其它基因家族均是一些未知功能的ORF，其中基因家族7中的ORF有73％相似、55％相同，同源性最高。

 

 

通过基因组序列分析，在WSSV双链DNA上找出编码50 aa 以上的ORF共684个，从中选出最少重叠的184个ORF进行同源性比较分析，推测功能性基因有11个，其中的一些基因已被鉴定。

早期关于WSSV结构蛋白的研究，主要采用Western blot分析和免疫电镜方法。近年来引用蛋白质组学方法，通过SDS-PAGE结合质谱(MS)分析或二维电泳结合MS分析，大大加速了WSSV结构蛋白的研究进展。目前，至少有39个结构蛋白已被发现或鉴定。用免疫电镜方法，已鉴定了WSSV的VP28、VP26、VP31、VP51C、VP36B、VP41A、VP12B和VP180为囊膜蛋白，VP664为核衣壳蛋白。用去污剂处理结合Western blot分析，确定并扩展了上述研究，结果表明，VP28、VP19和VP73为囊膜蛋白，VP24、VPI5和VP35为核衣壳蛋白，但矛盾的是，以前认定的囊膜蛋白VP26被鉴定为核衣壳蛋白。最近，Tsai等 用Western blot、免疫电镜和蛋白质组学等方法进行综合分析发现，病毒的囊膜蛋白为VPI9、VP28、VP31、VP36B、VP38A、VP51B和VP53A，核衣壳蛋白为VP664、VP51C、VP60B和VP15；尤其重要的是，该研究小组发现，在WSSV囊膜蛋白和核衣壳蛋白之间存在一个由联结(Tegument)蛋白构成的中间层，之前未确定的VP26即是存在于这两种病毒蛋白之间的联结蛋白，WSSV的这类蛋白还包括VP36A、VP39A和VP95。

概括起来，在SDS-PAGE胶上显示的WSSV主要结构蛋白有5个，包括VP28、VP24、VP26、VP19和VP15。已定位的囊膜蛋白是VP28和VPI9， 已定位的核衣壳蛋白是VP24，后者与VP28和VP26有很高的同源性，可能是基因复制后根据不同的功能分化而成的不同蛋白；从序列分析，VP15是DNA结合蛋白；VP26；曾先后被认为是囊膜蛋白和核衣壳蛋白，最近被确定为存在于WSSV囊膜蛋白和核衣壳蛋白之间的一种联结蛋白。WSSV的这5种主要结构蛋白都不存在糖基化，这与其它有囊膜病毒明显不同。

 

 

由于没有适合WSSV生长的细胞系，有关该病毒复制周期尚无系统性研究，只有零星的资料可供参考。

病毒入侵宿主通过病毒吸附蛋白与宿主特异性细胞受体的相互作用所介导，因此，寻找WSSV吸附和侵入宿主细胞过程中起关键作用的蛋白以及对虾细胞膜上的病毒特异性受体，对于WSSV的防治具有重要意义。虽然一些WSSV结构蛋白已被鉴定为囊膜蛋白，但对这些蛋白的功能所知甚少。Hulten等的研究证实，WSSV囊膜蛋白VP28的特异性抗体能中和病毒感染，提示VP28在病毒感染过程中起非常重要的作用，但VP28是否就是病毒的吸附蛋白，还有待于进一步的研究。Tsai等通过序列分析发现，WSSV有6个结构蛋白含RGD基序，包括囊膜蛋白VP110蛋白，虽然它们的功能尚不清楚。越来越多的证据表明，在病毒感染的起始阶段，结构蛋白的RGD基序对于识别和吸附到宿主细胞的表面起关键性作用。在蓝舌病病毒，VP7蛋白的RGD基序负责病毒对库蠓细胞的吸附；FMDV VP1的RGD 基序与整合素特异性结合，是该病毒的细胞吸附位点；HHV-8也通过RGD基序与整合素相互作用感染宿主细胞。最近，Li等用Western blot分析和免疫电镜检测表明，含RGD 基序的VP110是WSSV 的囊膜蛋白，它能黏附于宿主细胞，而且这种吸附作用可被合成的RGDT短肽所抑制，这提示，囊膜蛋白VPI10的RGD基序在WSSV感染中可能起重要作用。

有4个功能性蛋白可能涉及病毒的转录和复制，它们分别是ORF9编码的DNA螺旋酶、ORF27编码的DNA聚合酶、ORF66编码的cAMP应答元件结合蛋白和ORF149编码的TATA盒结合蛋白；还有几个基因编码的酶类与病毒的核苷酸代谢有关，包括含大小两个亚基(RRI，RR2)的核糖核苷酸还原酶、嵌合的胸苷／胸苷酸激酶(TK-TMK1、脱氧尿苷三磷酸酶(dUTPase)，这些酶的编码基因在WSSV基因组中已被鉴定，但在其它双股DNA病毒中存在的RNA聚合酶、poly(A)聚合酶以及mRNA 帽化酶等在WSSV基因组中并不存在。

在病毒感染过程中，WSSV基因的表达至少可分成早期和晚期两个时相 ，而且立即早期时相可能存在，尽管对(立即)早期和晚期基因表达的转换机制及其所涉及的启动子和调节序列所知甚少。许多真核细胞的大DNA病毒其基因表达呈协同级联方式，这包括在核中复制的杆状病毒和疱疹病毒以及在胞浆中复制的痘病毒，它们在复制的起始阶段表达早期基因、在病毒DNA开始复制后表达晚期基因。在核中复制的病毒利用宿主细胞的RNA聚合酶Ⅱ启动早期基因的表达，可是晚期基因的表达使用一种新的RNA聚合酶，该酶至少部分由杆状病毒自身的基因组编码；在胞浆中复制的痘病毒使用自身的RNA聚合酶合成早期和晚期mRNA，该RNA聚合酶在病毒粒子中被核衣壳包裹，当病毒到达胞浆时启动病毒基因的转录。

为研究保守的启动子基序，Mark等对WSSV基因组中早晚期基因的上游序列进行分析，结果表明，该病毒的早期基因含有类似于果蝇RNA聚合酶Ⅱ核心启动子序列中存在的TATA盒和起始子；可是，在用微阵列分析鉴定的WSSV晚期基因中，只有约半数含有TATA盒，已经确定的结构蛋白基因，则很少含有TATA盒。由此可将WSSV基因分成两类，一类利用细胞聚合酶Ⅱ系统合成mRNA， 另一类通过病毒诱导的新转录机制生产mRNA 。

感染虾的组织病理学研究表明，病毒主要感染外胚层和中胚层来源的组织，如胃、腮、心脏、肠、肌肉和造血组织，这些组织中的感染细胞以核增生和染色质边集为特征。病毒粒子主要存在于感染细胞的核中，提示病毒的转录、复制和组装可能发生在细胞核内。尚不清楚病毒粒子如何从感染细胞的核中释放，可能是通过出芽或核膜乃至细胞浆膜的破裂而发生。

 

 

在一定意义上讲，生态环境是养虾业面临的最严重的问题。对虾养殖池是一个高密度放养的相对独立的生态系统，生物种类有限，食物网复杂程度不高，自我调节能力小，稳定性差；另外，许多生态环境应激因子(Stressor)可诱发病毒性病害的发生。在生产实际中，可采用物理的、化学的和生物的方法改善和优化生态环境，构建有利于保持生态稳定的多种群生物群落，立体利用虾池生态位，提高对虾的健康水平和抵御疾病的能力。饲养管理方面，应重视培养和使用浮游动植物、可被利用的底栖动物及微生物等基础饵料；引进亲虾和苗种时，必须强化病毒性病害的检疫，包括产地检疫、养殖区检疫、对虾加工场检疫、以及进出口检疫等。筛选和培育无病和抗病的对虾种类，是另一个发展方向。20世纪90年代初建立的无特定病原(Special pathogen flee，SPF)和抗特定病原(Special pathogen resistant，SPR)虾苗技术，已取得了初步成功，这为筛选和培育无／抗WSSV虾苗提供了科学依据和思路。一旦发现病毒性病害的流行，主要措施是早发现、早诊断、早治疗，应迅速隔离并及时处理患病对虾，严格封锁疫区，对污染区进行紧急消毒，切断病毒的传播途径；同时，可利用诸如细菌肽聚糖等免疫增效剂，提高虾体免疫力和抗病毒能力。

 

 

国家海洋局第三海洋研究所在国际上率先破译WSSV遗传密码，标志着我国对虾WSSV基因组的研究进入世界先进行列；另外，武汉大学和沈阳药科大学等研究机构在WSSV基因结构与功能方面也取得重要研究进展。破译病毒基因遗传密码，揭示病毒遗传基因的结构和功能，进而了解病毒感染增殖的机理，是虾白斑病早期诊断、建立防治方法、开发抗病毒药物以及构建转基因抗病毒对虾的必要前提和基础，是获得本病防治对策的关键。

通过转录分析，一些WSSV基因可被分类为立即早期基因、迟早期基因、晚期基因和极晚期基因。众所周知，立即早期基因在病毒的裂解周期中起重要的调节作用。在前期的研究中，我们从WSSV基因组筛选出一个高效、泛活性启动子；对该启动子的结构进行功能性剖析发现，在TATA盒远端的一个12 bp序列是决定该启动子活性的主要顺式作用序列。由于该12 bp序列同业已存在的启动子基序无任何同源性，提示细胞中存在一种新的转录因子，通过与12 bp序列的相互作用调节WSSV基因的表达。目前，我们正采用DNA亲和层析技术提取这种12 bp基序结合蛋白，进而通过生物质谱分析对该蛋白进行分子定性(国家自然科学基金面上项目30670075，2007-2009)。这些研究，有助于了解WSSV的生命周期、感染模式和分子致病机理，并为建立抗WSSV药物筛选平台打下基础。