原位杂交技术及其在水产养殖中的应用

　　摘要 原位杂交技术是近年来快速发展起来的一门新技术。本文介绍了原位杂交技术的基本原理和几种常用的原位杂交技术，并概述了原位杂交技术在水产养殖中的应用现状，包括该技术在基因定位、性别鉴定和病毒检测等领域的应用。此外，还对该技术的应用前景进行了展望。

　　关键词 原位杂交 水产养殖 染色体

　　原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。1969年美国耶鲁大学的Gall等(1969)首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时Buongiorno-Nardelli和Amaldi等(1970)相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交技术。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。

　　1 原位杂交的基本原理

　　原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物(曾呈奎等)

　　1．1 组织、细胞或染色体的固定

　　在染色体原位杂交中要求染色体分散良好、长度稍长、无单体分离。在固定剂的选择和应用方面要兼顾3个方面：(1)保持细胞结构。(2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平。(3)使探针易于进入细胞或组织。一般认为DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定且易被酶合成和降解，RNA却非常容易被降解。因此对于DNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要，相反在RNA定位上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，不仅要考虑固定剂的种类和浓度，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。在固定剂中，最常用的是多聚甲醛。与其他的固定剂(如戊二醛)不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透进入细胞或组织。其他如醋酸-酒精混合液和Bouin’S固定剂也能获得较满意的结果。在实际操作过程中，常需要加入较强的增强组织通透性的试剂，如：应用酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、淀粉酶等，可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低RNA的保存和影响组织结构的形态，因此在用量及孵育时间上应小心掌握。至今多聚甲醛仍被公认为原位杂交中比较理想的固定剂。

　　1．2 探针的类型及发展

　　探针是原位杂交中用于细胞内特定DNA或mRNA序列定位的一段特定的核酸序列。根据探针的核酸性质的不同可分为DNA探针和RNA探针两大类。早期应用的主要是DNA探针，在DNA探针的选择上应尽量选有编码序列(外元)的DNA片段作为探针，避免使用内元和其他非编码序列。20世纪70年代Temin等(1971)在研究致癌RNA病毒时制备了cDNA探针，其基本原理是以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下产生的。cDNA中不含内元和其他重复序列，是较为理想的核酸探针，但制备困难。RNA探针是将特异性的cDNA片段插入含有相当的RNA聚合酶启动子的转录性载体。通过改变外源基因的插入方向可以控制RNA的转录方向，即以哪条DNA链为模板转录RNA，从而可以得到与mRNA同序列的同义RNA探针和与mRNA互补的反义RNA探针。DNA合成仪的诞生使人工合成寡核苷酸成为可能，与上述探针不同的是寡核苷酸探针不是克隆性DNA探针，它是由DNA合成仪依照所需杂交的靶核苷酸序列合成的，具有制造方便、价格低廉等优点，但其特异性不如克隆性探针强，杂交信号也较弱。

　　1．3 核酸探针标记的方法

　　随着原位杂交技术的发展，标记核酸探针的方法从使用放射性的标记物到应用非放射性的标记物(Raybum et al．1985)检测的灵敏度越来越高，并且应用的范围也越来越广泛。最初的原位杂交是利用具有放射性的探针检测细胞中特定基因在染色体上的位置和表达，例如使用。3H 、32P和35S等放射性同位素标记探针。放射性同位素标记探针对样品要求不太严格并且灵敏度高，但是对杂交信号的分析存在许多缺点，如每次检测均需重新标记探针，检测时间长，信号分辨率低等(吕忠进等1993；奇文清等1996)。此外，用同位素标记的探针具有放射性，既污染环境又对人体有害，且受到半衰期的限制等缺点，人们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。Bauman等(1981)首先应用荧光素标记eRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。随着生物素和地高辛标记探针技术的建立，更加丰富了核酸探针的标记方法。生物素标记技术是利用生物素标记的探针在组织切片上检测病毒DNA，通过生物素与抗生素的结合，过氧化物酶一抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。近年来，地高辛(Digoxingonin)标记技术日渐兴起，越来越受到科研工作者的青睐。和其他非放射性标记物一样，地高辛标记系统安全、方便、节省时间，同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术优越，可以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。地高辛标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。

　　2 几种原位杂交技术

　　2．1 基因组原位杂交技术

　　基因组原位杂交(Genome in situ hybridization，GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。GISH技术最初应用于动物方面的研究(Pinkel et a1．1986)，在植物上最早应用于小麦杂种和栽培种的鉴定(余舜武等 2001；王文奎等 2000)。

　　2．2 荧光原位杂交技术

　　荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切片上的特异片断进行杂交，通过荧光检测系统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂交位点。FISH技术检测时间短，检测灵敏度高，无污染，已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。

　　2．3 多彩色荧光原位杂交技术

　　多彩色荧光原位杂交(Multicolor fluorescence in situ hybridization，mFISH)是在荧光原位杂交技术的基础上发展起来的一种新技术，它用几种不同颜色的荧光素单独或混合标记的探针进行原位杂交，能同时检测多个靶位，各靶位在荧光显微镜下和照片上的颜色不同，呈现多种色彩，因而被称为多彩色荧光原位杂交。它克服了FISH技术的局限，能同时检测多个基因，在检测遗传物质的突变和染色体上基因定位等方面得到了广泛的应用(杨明杰等1998)。

　　2．4 原位PCR

　　原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量分析。原位PCR技术大大提高了原位杂交技术的灵敏度和专一性，可用于低拷贝甚至单拷贝的基因定位，为原位杂交技术的发展提供了更广阔的发展前景。

　　3 原位杂交技术在水产养殖中的应用

　　3．1 基因定位

　　原位杂交技术应用最成功的是基因定位，基因定位研究是构建基因图谱的基本要素。在鱼类中，原位杂交技术主要用于特异重复DNA的定位(李 奎等 1995)、多拷贝基因的定位(Smith el a1．1990)和鱼类染色体特异探针的制备与应用(Phillips el a1．1996)。Pendas等(1994b)利用荧光原位杂交技术对鲑、鳟和虹鳟的组蛋白基因簇进行了定位，结果表明，组蛋白基因在这几种鱼中只有一个位点。Gornung等(1997)以18s rRNA基因为探针对杜氏鰤鱼(Seriola dumerili)进行了荧光原位杂交分析，得到的结果与通过银染和色霉素染色得到的NOR位点相吻合，而且所有的NOR顺反子都是有活性的。王泽群等(1999)采用地高辛标记鲤鱼基因组DNA重复序列CRI对兴国红鲤的染色体进行原位杂交，发现CRI的杂交信号主要分布在一些染色体的着丝粒区。翁幼竹等(2000)用地高辛标记的寡核苷酸探针对GnRH受体在文昌鱼神经系统、哈氏窝和性腺中的定位和表达进行了研究。结果表明，神经系统中神经细胞、尤其是在中脑右侧延伸出与哈氏窝相接触的漏斗样结构中的神经细胞、哈氏窝上皮细胞以及雌、雄性腺中生殖细胞都有GnRH受体mRNA杂交信号，信号物质分布于胞质，胞核为阴性。在贝类方面，Clabby等(1996)通过荧光原位杂交技术，将卫星DNA Cg170定位到原位杂交技术及其在水产养殖中的应用牡蛎的两对染色体的端粒和亚端粒区域，但没有指明定位的特异染色体，后来王永平等(2O01)将此卫星序列重新定位在长牡蛎染色体的着丝粒处。在整个双壳贝类甚至在整个贝类中Cgl70可能是第一个定位到牡蛎着丝点区域的卫星序列。此外，还将牡蛎核糖体rDNA定位到长目力的第10对染色体上和美洲牡蛎的第2对染色体上(wang et al．2000、2001)。在斧蛤，报道了一个以160 bp为重复单位的卫星DNA家族，这个家族的脊椎动物端粒序列已经被定位到所有染色体的端粒区域(Plohl et a1．1997)，在贻贝报道了一个以173 bp为重复单位的卫星序列，约占基因组的0.6% (Ruiz et a1．1992)。李 奎等(1995)用地高辛标记原位杂交技术将黄膳的rRNA基因定位于二价染色体的3q12-q14和7q14-q26位置上。

　　3.2 性别鉴定

　　性别控制对加快选种进程，提高经济效益有着非常重要的作用。鱼类的性别类型多(XX／XY、

　　XX／XO、ZW／ZZ、ZO／ZZ)性别鉴定系统比较复杂。Nakayama等(1994)通过消减克隆的方法对兔脂鲤鱼的基因组DNA进行了检测，从10个插入克隆中发现两个克隆存在性别特异性的模式。通过原位杂交发现，在24个个体中有21个个体具有与其性别相符合的染色体特征和杂交模式，1个雌鱼具有雄鱼的特征，两个雄鱼具有雌鱼的染色体特征和杂交模式，这3个非典型个体可能是由于Z染色体和w染色体区域间的基因交换造成的。Iturra等(1998)以900 bp的探针结合RAPD分析确定了虹鳟的性染色体分子标记，发现在一个形态上似Y染色体的染色体上具有一个明显的RAPD信号，这一发现对于这一种类的性别决定具有重大的意义。

　　3．3 病毒检测及诊断

　　原位杂交技术是分子生物学与组织化学相结合的一种技术，它从细胞水平上在原位研究特异核酸的分布、数量以及细胞分化、生理、病理状态、形态特征演化之间的关系(吕玲等2000)。由于原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，而且不需要从组织中提取核酸，而对于组织中含量极低的外源染色体片段有极高的敏感性，因此，此技术自1993年以来广泛应用于对虾病毒的检测以及对虾病毒病的诊断。较早的是Bruce等(1994)利用此技术检测感染杆状病毒(BP)的对虾的各种器官。在国内，雷质文等(2001、2002)用PCR法制备地高辛标记的探针，采用原位杂交技术对中国对虾和克氏原鳌虾体内的白斑综合征病毒(WSSV)进行了检测。结果表明，此技术在对虾暴发性流行病的诊断方面具有很高的应用价值。吕玲等(2000)采用原位杂交对对虾的白斑综合征病毒的组织特异性进行了检测，所得到的阳性细胞个数比HE多，而且探针的敏感性随探针长度的增加而降低。邓敏等(2000)运用建立的WSSV部分基因组文库，将WSSV EcoR I克隆片段标记制备为探针，进行原位杂交，其结果证明了克隆片段对WSSV的特异性，并为检测WSSV提供了方法。

　　3.4 其他方面的应用

　　原位杂交技术除了在上述方面的应用之外，在检测药物耐药性方面也得到了应用。杨汉春等(2001)、赵静等(1999)以随机引物法，用地高辛标记制备成探针，成功建立了菌落原位杂交法用于检测猪源大肠杆菌和猪源大肠埃希氏菌对卡那霉素和四环素抗药性的研究，结果表明与药敏试验的阳性符合率分别为100％和91.7%。

　　4 展望

　　综上所述，原位杂交技术因其高度的灵敏性和准确性而日益受到许多科研工作者的欢迎，并广泛应用到基因定位、性别鉴定和基因图谱的构建等研究领域。目前原位杂交技术在植物中的应用比较广泛，例如在棉花、麦类和树木等的遗传育种方面取得了显著的成就，在畜牧上原位杂交技术主要用于基因定位和基因图谱的构建以及转基因的检测和性别鉴定等方面。在水产方面，原位杂交技术则主要应用于基因定位(多见于对鱼类和贝类等水生物的研究)和病毒的检测(多见于虾类)。此外，原位杂交技术做为染色体高分辨显带技术的补充和发展，在水生物的细胞遗传学的研究领域将发挥更重要的作用。同其他的生物技术一样，原位杂交技术在其发展与应用的过程中会出现一些问题，但随着原位杂交技术的不断改进与完善以及检测手段的改进，原位杂交技术的优越性越来越突出，其应用也会更加广泛。