对虾的主要疾病及其诊断方法

中国水产门户网报道我国的对虾养殖业由以黄、渤海地区大排大灌养殖中国对虾(Pena-eus chinensis)为主的养殖模式,经过近10年的探索发展为以南海地区封闭式健康养殖南美白对虾(P.vannamei)为主的养殖模式,产量由1994年的638-72t,增至2000年的217994t,远超过了西半球的对虾产量(1700-00t),并总结出一套完整实用的防病和诊断技术。   
    
    1 虾病的发生   
    
    养殖对虾患有传染性(病毒、立克次氏体、细菌、霉菌、原生生物和后生生物病等）和非传染性（环境恶化、营养失衡、毒物和遗传因子等病）的种种病害。   
          
    对虾发病是对虾(种类,规格,发育阶段,生理状况等),环境（生物与非生物等)和病原(种类,密度,致毒力等)三者相互作用的结果[9，10]。许多对虾病是多病原或多病因的。病毒感染不仅常伴有细菌和外寄生物次生感染，后者可能引起对虾死亡，而且可能是多种病毒同时感染。如在感染白斑综合症病毒(WSSV)的斑节对虾(P.monodon)中就同时发现了黄头病毒（HVY）。

    1974年Couch报道了首例对虾病毒，1992年前人们共发现了6种对虾病毒,目前已发现了DNA病毒和RNA病毒2大类,20多种,分属7个科。

    DNA病毒有细小病毒科Parvoviridae(包括皮下及造血组织坏死病毒病IHHNV,肝胰脏细小病毒HPV,类淋巴器官细小病毒LOPV、杆状病毒科Baculovir-idae(杆状对虾病毒BP,斑节对虾型杆状病毒MBV,澳洲对虾杆状病毒PBV,中国对虾杆状病毒PCBV, 斑节对虾C型杆状病毒LOBV,白斑综合症杆状病毒WSSV、外胚层和中胚层系统杆状病毒病SEMBV,和虹彩病毒科Iridovi-ridaeIRIDO-VIRIDAE(IRDO对虾虹彩病毒)；RNA病毒有呼肠病毒科Re-oviridae(呼肠类病毒-ⅢREO-Ⅲ、呼肠类病毒-ⅣREO-Ⅳ)、披膜病毒科Togaviridae（淋巴器官液泡化病毒LOVV)、弹状病毒科Rhabdoridae(对虾杆状病毒RPS、黄头症病毒YHA）和小RNA病毒科Picornaviridae(Nad-aviridae)（拖拉综合病症病毒TSV）。

    南美白对虾易患拖拉病，且抗病力不随规格增大而增强；蓝对虾抗拖拉病的能力较白对虾强;南美白对虾抗IHHNV病的能力较蓝对虾强；规格越大抗IHHNV的能力越强，经3轮选育的无特异病原的南美白对虾成活率提高1倍多，增重率提高21.2%；无特定病原中国对虾生长快。

    WSSV、MBV、BMV、HPV、IHHNV和YHA是亚洲和印度---太平洋地区对虾的重要病原，而TSV、IHHNV和BP是美洲对虾的主要病原。但近年台湾和南方的南美白对虾也爆发了拖拉病，引起对虾大批死亡，我国北方对此须高度警惕。   
    
    2 对虾病原的诊断方法   
     
    对虾病原的诊断方法最早是用光学显微镜直接观察，后用电子显微镜观察，再用组织学、血清学和微生物学方法，现采用敏感的现代生物技术方法。

    2.1 血液学和临床化学

    血液学和临床化学是诊断人、畜病原的主要手段；血细胞数、凝血时间、血液中葡萄糖、氮、氨SGOT(serum glutamic oxaloacetic tra-nsaminase,血清谷-草转氨酶)、碱性磷酸酶和血液总量等血液指标也是对虾和龙虾传染性疾病的重要指标，但只有血淋巴凝固时间和血球数量变化可用于虾病诊断。

    2.2 组织培养

    组织培养法是鉴定有鳍鱼类大多数病毒的主要方法,目前已知至少有5种病毒活细胞。许多甲壳动物（对虾、蟹、龙虾）研究者试图研制细胞株，通过组织培养来鉴别对虾病毒，虽然有些报告声称获得了成功，但目前尚未应用到对虾病毒的诊断中。

    2.3 毒力学分析方法

    对虾的非传染性疾病可用毒理学分析方法来诊断。如中毒性病症可根据特殊病理的组织斑块来确诊:蓝藻中毒引起血细胞性肠炎(中肠出现炎病斑);农用杀霉菌剂（benomyl）中毒时肝胰脏中出现特殊的阏点;黄曲霉毒素病和某些黑鳃和黑壳病也具有特殊的组织症状；残饵和排泄物污染使酚氧化酶、SOD和溶菌酶活力下降;肌肉痉挛、软壳、胡萝卜素缺乏、维生素C缺乏症等都具有特殊的组织学症状,要依病史和检查结果来确诊。   
     
    2.4 血清学方法

    血清学诊断已用于对虾病原的诊断。目前已研制出几种弧菌和病毒的单克隆(Mab)和多克隆(Pab)抗体来诊断对虾病原。如创伤弧菌(Vib-rio vulnificus)和哈氏弧菌(V.harveyi)的酶标记免疫吸附测定法(EL-ISA)；解藻朊酸弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemoly-ticus)、创伤弧菌和哈氏弧菌的单克隆抗体；日本对虾中肠腺坏死状病毒（BMN）的荧光对氨基苯甲酸检测(PAb)；对虾杆状病毒(BP)的ELISA法。目前正在完善IHHNV、HPV、YHA、BP和WSSY的单克隆抗体，解决ELISA中免疫球蛋白（IGM）Mab与正常组织成分的非特异性反应问题，以提高诊断准确性。薛清刚等（1995）用密度梯度离心纯化的HPV颗粒免疫制备特异性抗原血清，建立了一种反向间接血凝法诊断HPV感染。该方法的敏感性达ng/ml病毒蛋白的检测水平。

    2.5 分子方法

    第一代IHHNV基因探针是从患病的南美白对虾IHHNV中提纯ssDNAr，将其“正”和“负”链分配成dsDNA，再把dsDNA的“纯端”拉长成载体PUC18，最后在大肠埃希氏杆菌(E.coli)-DH-5细胞中克隆而成。从已克隆的IHHNVDNV片断文库中选出了5个2.0kbp或更大一些的DNA克隆进一步研究它们分别称为BS4.5、BG45、BA401、BA402和DR22，这其中的4个分别含有2.3，2.0,3.2和2.2kbp插入片段。按照其限制酶谱组装在一起，这5个克隆约相当于95%4.1k-bIHHNV的ssDNA基因组。  
             
    设备先进的实验室曾用放射标记的基因探针来诊断对虾病原，后来用非放射性的Genius TMI试剂盒基因探针诊断对虾病毒病。这种探针含有异羟洋地黄酶苷元-11dUTP（DIG）作DNA标记物，最终用ELISA系统检测，制造出了IH-HNV的非放谢性DIG基因探针诊断盒，商品名为Shrimp-Probes by Diag X-ot-ice(Wilton, C.T.USA).自1992年对虾细小病毒IHHNV基因探针问世以来，这项技术一直被用于对虾病毒、立克次氏体状细菌和微孢子虫的诊断中，专门诊断细胞内立克氏体状细菌引起的肝胰脏坏死病原和寄和在东南亚斑节对虾和墨吉对虾（Penaeusmerguiens-is）体内的对虾八孢虫（Agmasoma sp）。

    目前，PCR技术已广泛应用于对虾病原的诊断。通常，少量的DNA扩增后利用针对靶DNA的专一寡核苷引物，即产生可检测的靶DNA，再用PCR产物通过凝胶电泳与已知的标准比较，即与膜上的专一DNA探针反应。有时PCR产物本身就标记DIC作为专一的DNA探针。

    模板DNA的制备是PCR检测中的首要工作。用于PCR检测的样品必须经去除抑制Taq酶活性的各种杂质、部分纯化样品中的核酸等处理后才能使用。制备检测IHHNV的PCR模板的关键在于去除蛋白质并解聚病毒的核衣壳。其常用的方法有酚-氯仿抽提法、蛋白酶水解法、玻璃乳提取法、硝酸纤维膜吸附提取法等。王馗等（2000）比较了上述几种方法以后认为，煮沸-乙醇沉淀法是一种快速、简捷的从SEMP-Tris采样液中保存的病虾组织中制备PCR模板的方法，用于PCR检测IHHNV效果很好。

    2.6 形态与生态结合法

    IHHNV是目前已知最小的对虾病毒，而且东、西半球的差异较大。对虾杆状病毒(BP)的大小介于IHHNV和WSSV之间，且在南美洲自北向南、在美国自西向东减小,很可能有2或3个品系。日本对虾幼虾的BMNV在4℃下用乙醚处理存活不到18h；在25%,12.55，0--6.0%NaCl溶液中分别于10h,24h和>24h内不再活动。当pH值为1,1.5--2.0,2.5,3--4时,BMNV分别在10,30,60,180min内不再活动。海水中的BMNV在30,25,20℃和15℃下,4,7,12d,或20d时不再活动.在15W灯,距离30cm的条件(4.1×105μW)下照射30min,或在30，45，50~55，60℃下，晒3h，120，30，5min后，BMNV不再活动而失活。