大珠母贝3个养殖种群的RAPD初步分析

中国水产门户网报道摘 要 采用RAPD方法对大珠母贝中培育大型珍珠应用较多金唇(G)贝、银唇(s)贝和黄唇(Y)贝3个养殖种群的分子遗传学特性进行了研究。s、G和Y的多态位点比例 P分别是72.22％、75.56％和80.00％；G、s和Y的基因多样性指数分别为0.2846、0.2891和0.2904。G种群基因多样性指数和Shannon信息指数均高于其余2个种群；s种群的基因多样性指数高于Y种群，但是其Shannon信息指数低于Y种群。3个种群两两间的遗传一致性程度均较高，最低的是Y种群和s种群间的遗传一致性，为0.8757，最高的是G种群和Y种群间的遗传一致性，为0.9283，表明3个种群间，尤其是G和Y种
群间的亲缘关系较近，这与它们间形态学上的相似性程度相一致。
　　关键词  分子遗传学  大珠母贝  养殖种群

    大珠母贝，又称白蝶贝[Pinctada maxiln(Jameson)]，是最大型的一种养殖海水珍珠的贝类，最大个体壳高达30cm以上，体重大于5kg(王如才等，1993，)，是生产大型优质海水珍珠最理想的珍珠贝。大珠母贝培育的珍珠因具有珠大、珍珠质层厚和珍珠光泽丰富等优点而备受人们亲睐，价值大大高于马氏珠母贝培育的“南珠”。根据大珠母贝贝壳内表面外周珍珠质颜色的差异，可以分为金唇(Gold-lip，G)贝、银唇(Silver-lip，s)贝和黄唇(Yellow-lip，Y)贝等。金唇贝生产的金色珍珠价值最高，银唇贝生产的银白色珍珠价格不菲，而南黄唇贝生产的黄色珍珠价值远远低于上述两种珍珠。澳大利亚和印度尼西亚的大珠母贝养殖较发达，形成了金唇贝、银唇贝和黄唇贝等不同养殖种群，不同种群生产珍珠所产生的价值的差异使我们意识到有必要从分子生物学水平探讨这些种群的遗传差异和建立分子判别方法。
    随机扩增片段长度多态性(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)已被广泛地应用于陆生动物研究。近几年来，该技术被用于从核酸分子水平上对鱼、虾、贝等主要水产生物的亲缘关系及其演化过程的研究，但是主要研究对象是鱼类(Bardakci and Skibinski。1999；Zhou et a1.，2000a,h)，对其它海洋动物尤其是珍珠贝的研究较少。本文自印度尼两亚取不同养殖种群大珠母贝的闭壳肌为材料，采用RAPD技术，对种群内和不同种群间的遗传多样性和遗传距离进行了初步研究。

　　1　材料和方法

    1.1  材料
    大珠母贝的三个养殖种群G、S、Y均取自于印度尼西亚，三个种群取材样本数分别为49、50和50个。取新鲜的大珠母贝闭壳肌，70％乙醇固定2小时，换用95％的乙醇，2-4小时后再换一次95％乙醇，于-20℃保存备用。
    1.2 实验方法
    1.2.1 基因组DNA的提取
    每个样品称取0.2 g闭壳肌，0.8％生理盐水漂洗，剪成细末，置于1.5ml离心管中，加入0.5ml STE[10 mmol／L Tris.HCl、PH 8.0，1 mmol／L EDTA(PH 8.0)，1 0 0 mmol／L NaCll、65斗l 10％的SDS和6μl蛋白酶k(10mg/m1)，  颠倒混匀，55℃保温消化4—6小时，消化过程中每30分钟颠倒混匀一次。待肌肉消化完全后依次以等体积酚／氯仿(酚：氯仿：异戊醇=2 5：2 4：1)和氯仿／异戊醇(氯仿：异戊醇=24：1)各抽提2次，然后加入2倍体积的无水乙醇室温沉淀DNA 30分钟以上，70％的乙醇洗涤沉淀2次，DNA沉淀于室温干燥15分钟后溶于25μl灭菌双蒸水，取1μl琼脂糖凝胶电泳，检测DNA质量和估计浓度，其余DNA置-20℃备用。
    1.2.2  RAPD扩增
    PCR主要参照Williams等(1990)，对各参数适当调整优化。扩增反应总体积15-25μl。其中包括1×扩增缓冲液(10 mmol／L Tris.HCl、PH 8.3，50 mmolfL KCl，0.001％明胶)，200μmol／L的dNTPs，RAPD引物0.2μmol／L，MgCl220mmol／L，IU Taq DNA聚合酶，15～200 ng基因组DNA。扩增参数为：94℃预变性4 min；94℃ 30See，36℃ 30 Sec，72℃ 1 min 30 Sec，45个循环；72℃延伸5 min。
    1.2.3 电泳观察
    扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离(1×TBE，3V／cm恒压)，EB染色，凝胶成像系统观察和拍照。
    1.2.4 数据分析
统计各个样品的扩增带，转换为0(无带)、1(有带)数据，将(0、1)矩列数据输人计算机，用PopGen 32生物软件进行处理。将RAPD标记作为等位基因，计算各种群的多态位点比例P、种群内的遗传多样性值和种群问的遗传距离等。P=多态性扩增片段数，扩增片段总数；种群内的遗传多样性值D=I-Sxy，遗传相似性指数Sxy=2 Nxy／(Nx+Ny)，相对遗传距离Dxy=-ln(Sxy／Sx·Sy)，其中Nxy是个体x和个体y共有位点数，Nx和 Nv分别是个体x和个体y共扩增出位点数。群体内的相似性指数为此群体内所有个体间相似性指数的平均值，群体问的相似性指数为两群体任意两个体的相似性指数的平均数。Sxy为两群体问的相似性指数，sx，sy分别表示群体x和群体Y的相似性指数(Nei，1972，1973)。Shannon信息指数(Shannon's Information index)按照公式H=-∑πilnπi/N计算，其中，πi为某一条带在群体中出现的频率，ln为自然对数，N为群体总的位点数(Wachia et al.,1995)

　　2　结果

    2.1 引物筛选和RAPD图谱分析
    购自于大不列颠哥伦比亚大学(the University 0f British Columbia)的RAPD set#1的100条引物和购自博亚生物技术有限公司(上海)的编号为BA0001-BA0200的200条RAPD引物进行了筛选，分别获得了0008，0011，0090，0091，0092，0096和BA0029，BA0033，BA0045， BA0093，BA0097，BA0105，BA0108，BA0156，BA0158，BA0197共16条能够在各个群体中都能够扩增清晰出带纹的的随机引物。



    16条引物在各个体中扩增的片段数在2-12条之间，片段大小位于0.2-3.5 kh，主要集中于0.5Kb-2.0 kb(图1显示)。个体之间和群体之间的扩增都存在差异，没有两个个体的扩增结果完全相同，反映了各个体问基因组成存在一定的差别，同时显示RAPD具有较高的分辨率。3个大珠母贝种群共检测到90个位点，其中，多态性位点数分别为G 68个，S 65个。Y 72个，多态位点比例P由大到小顺序依次为：PY>P>c Ps；对三个种群总体而言，90个位点仅有5个完全相同，位点多态性为94.4％(表1)。
    2.2 遗传分析
    三个大珠母贝种群内的基因多样性指数和Shannon信息指数见表2。结果显示，无论是基因多样性指数还是Shannon信息指数，G种群的值都要高于其余2个种群；s和Y种群由于计算方法不同结果存在差异，s种群的基因多样性指数高于Y种群，但是其 Shannon信息指数低于Y种群。


注：对角线以上为种群问遗传相似性，对角线以下为种群问遗传距离。

    种群问的遗传分析(表2)结果表明，三个种群两两问的遗传一致性程度均较高，最低的是Y种群和S种群问的遗传一致性，为0.8757，最高的是G种群和Y种群问的遗传一致性，为0.9283。S种群同G和Y种群问的遗传距离较大，分别为0.1315和0.1328，几乎相同；G和Y种群问的遗传距离较小，为0.0744。

　　3　讨论

  3.1  大珠母贝种群内的遗传多样性比较
  大珠母贝三个养殖种群的多态位点比例都很高，其范围在72.22％-80.00％之间，其中黄唇贝Y最高，暗示绝大多数RAPD位点在各个种群内都还没有完全纯合。此外，无论是N。i基因多样性还是Shannon信息指数，各养殖群体的值都较高，分别处0.2846-0.291M和0.4224—0.4257范围间，也表明种群内个体问具有较大的遗传差异，遗传多样性程度比较高。马氏珠母贝的研究表明(王爱民、邓凤娇等，2000；王爱民、阎冰等2003)，马氏珠母贝野生种群内的遗传多样性较高，Nei基因多样性值在0.312-0.4134问，而养殖群体内个体差异较小，Nei基因多样性值仅有0.284，与本研究结果相似。大珠母贝养殖群体遗传多样性与马氏珠母贝养殖群体相似，可能暗示大珠母贝的野生种群和养殖种群的遗传多样性特征与马氏珠母贝相似：野生种群的遗传多样性原本较高，但是由于人工繁殖，亲本数量的局限、非随机交配和多代选育，导致了遗传多样性降低。进一步对大珠母贝野生种群的研究有助于阐明其同养殖种群的遗传多样性关系。
    尽管金唇贝G的位点多样性比例较黄唇贝Y低，但是，G的Nei基冈多样性和Shannon信息指数均较其余2个种群高，原因可能在于G群体中在较多个体中得以体现的多态位点比例比s种群和Y种群高。S种群的Nei基因多样性值较Y种群高，然而，s种群的Shannon信息指数却比Y种群低，这种同一原始数据通过不同的计算方法得出的结果的不一致性，一方面表明S种群和Y种群的种群内遗传多样性程度需要更多的分子标记方法和数据分析处理方法才能够比较与确定，另一方面，暗示数据的生物统计分析理论和方法有待于进一步完善。
    3.2 大珠母贝种群间的遗传相似性和遗传距离比较
    3个大珠母贝种群两两问的遗传一致性都很高，大于0.8757，表明它们问的亲缘关系很近，在大珠母贝的分子进化过程中的分化发生较晚。形态学性状上，3个种群除了在贝壳内表面唇的色泽存在差异外，其余性状很难彼此区分，即形态学性状的一致性很高，这与本文在核酸分子水平上的研究结果一致。
    在色泽上，金色唇和黄色唇更接近，而白色唇与二者的差异则要明显得多。G种群和Y种群问的遗传距离最低；G种群和Y种群各自与S种群问的遗传距离相对较大，而且这种遗传距离差异大约相同，分别为0.1315和0.1328。表明G种群和Y种群问的亲缘关系最近，二者的共同祖先类群与银唇贝分离后，以相似的演化速度形成了现在的金唇贝和黄唇贝。

主要参考文献
l、王如才，王昭萍，张建中。海水贝类养殖学。青岛：青岛海洋大学出版社，1993P208—209
2、王爱民、邓凤娇、张锡元、阎冰叶力，毛勇，张木先.马氏珠母贝遗传多样性的RAPD分析。武汉大学学报.2000，46(4)：467—470
3、王爱民、阎冰、叶力、邓凤娇、张锡元、武波。三个野生种群马氏珠母贝遗传多样性的RAPD研究。农业生物技术学报，2003，11(2)：163—168
4、Bardakci，F，Skibinski DO.A polymorphic SCAR—RAPD marker between species()f tilapia(Pisees：Ciehlidae).Anim Genet,1 999，30：78—9.
5、Nei M.Genetic distance between populations.Am Nat,1972.106：283—292.

作者简介
石耀华，1970年10月，海南大学海洋学院，副教授，主要从事水牛动物遗传、育种和发育等领域研究，海南省海口市人民路58号，邮编：570228，电话：0898—68263920；  e—mail：slone70@sina.com ,通讯作者：王爱民，aimwang6@hotmail.com 

（石耀华  王嫣  王爱民  顾志峰）