固定化微生物技术及其在水产养殖中的应用

中国水产门户网报道    摘 要:本文介绍了固定化微生物技术的发展史和吸附法 (载体结合法)、包埋法、共价法、交联法等6种固定化微生物的制备方法以及固定化微生物技术在水产养殖中的应用。
    关键字：固定化；微生物；水产养殖；制备
 
    随着水产养殖业的发展，养殖对象、规模日益扩大，细菌性、病毒性等病害的感染机率也随之增大。而抗生素的大量使用，不仅使一些致病菌产生较强的抗性，同时也导致了鱼肠道内的有益菌群生态失调，从而影响鱼类的抗病能力。要减少抗生素使用，保护生态环境，应另辟蹊径。微生态制剂则可相对有效地解决这一问题。所谓微生态制剂，是利用对鱼虾等动物有益的微生物或促进物质经特殊加工工艺制成的活菌制剂。它可用于水中微生态调控、净化水质，能产生一定的生物效应或生态效应；也可用于调整或维持动物肠道内微生态平衡，达到防治疾病、提高健康水平和促进生长的目的。目前微生态制剂被广泛应用在水产养殖业上，但在应用中发现：由于微生物受外界环境影响较大,抗不良环境冲击能力差,一旦系统受损难以恢复，因此处理效果不稳定。为了解决这个问题，人们将目光投向了固定化微生物技术。固定化微生物技术不仅有利于优势菌种的固定，提高难降解有机物的降解效率；还能在生物装置内维持高浓度的生物量，在无细胞冲出的前提下，液流量大，提高了处理负荷，减少了处理装置的容积；并且易于固液分离；同时微生物被高分子材料包埋后抗毒性能和耐受力明显增加。
 
    1固定化微生物技术
    固定化生物技术起始于1959年,由Hattori等人首次实现了大肠杆菌的固定化,此后发展迅速。它包括固定化酶和固定化细胞技术。所谓固定化是指利用物理或化学手段将游离的细胞或酶与固态的不溶性载体相结合，使其保持活性并可反复使用的一种技术。由于固定化在实际生产中可使生产工艺自动化、连续化，提高酶和细胞的稳定性和反应效率，降低成本，因而迅速成为生物工程学中的一个研究热点。顾名思义，固定化微生物技术是指利用化学的或物理的手段将游离的微生物定位于限定的空间区域，并使之成为不悬浮于水仍保持生物活性，可反复利用的方法。20世纪70年代以后，由于水污染严重，迫切需要一种高效、快速且能连续处理的废水处理技术，微生物固定化技术从而在污水处理中得到广泛应用，效果较好，至今已经形成了较为完备的理论和方法。
 
    2固定化微生物的制备方法
    从固定化的定义就可以看出，要实现微生物固定化就要求有固态的不溶性载体。目前常用的载体可分为无机载体、有机高分子载体和复合载体三大类型。常见无机载体有硅藻土、多孔玻璃、石英砂、活性炭等；有机载体有琼脂、角叉莱胶、海藻酸钙和一些有机合成高分子凝胶（如聚乙烯醇凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、光硬化树脂）等；复合载体是由无机载体和有机载体材料结合而成，使两类材料的性能互补。
    固定化微生物的制备方法主要有吸附法 (载体结合法)、包埋法、包络法、共价法和交联法(架桥法)和无载体固定法6种。
    2.1吸附法
    所谓吸附法就是依据带电荷的细胞和载体之间的静电、表面张力和粘附力的作用，使细胞固定在载体表面和内部形成生物膜。这是一种廉价有效和比较常用的方法，其可分为物理吸附法和离子吸附法两种。物理吸附法是使用具有高吸附能力的物质,如硅胶、活性炭、多孔玻璃、碎石、硅藻土、多孔砖、陶瓷片、木屑等吸附剂，将微生物吸附在表面使其固定化；离子吸附法是利用微生物在解离状态下离子键合作用而固定于带有相反电荷的离子交换剂上，常见的离子交换剂有DEAE-纤维素、CM-纤维素等。
    2.2包埋法
    包埋法是将微生物包裹于凝胶格子或聚合物半透膜微胶囊中的方法。包埋材料通常采用聚乙烯醇(PVA)、丙烯酞胺(ACAM)、聚乙烯乙二醇（PEG）、琼脂、海藻酸钙、卡拉胶等，其中天然高分子凝胶对微生物细胞无毒，传质阻力小，但结合强度小；有机合成高分子凝胶强度高，影响微生物生物活性，同时传质阻力大。由于包埋法所需条件温和、回收率较高，具有一定的普适性，选择适当的包埋材料使其不会破坏微生物的活性是这项技术的关键，但该方法空间位阻大，故不适于固定对大分子有机物作用的微生物。共固定化技术是在混合发酵技术和固定化技术基础上发展起来的一门新技术，就是将几种细胞同时包埋于同一载体中形成共固定化细胞系统。这种系统稳定，可将不同的几种微生物协同作用。混合细胞的固定化技术综合了混合发酵和固定化技术的优点，与遗传工程构建的细胞相比更有希望在短时间内应用于生产。
    2.3包络法
    20世纪90年代初期，为克服吸附法和包埋法固定微生物的缺点，又提出用包络法固定微生物的新技术。包络法以人工合成生物相容性好的聚丙烯酸酯共聚物基体型多孔颗粒为载体。郑邦乾等研究表明，微生物既可在该多孔载体外表面生成机械强度高的生物膜,又可在载体内孔中聚集大量的微生物，增大了微生物的聚集密度，而且提高了生物粒子承受水力负荷的能力。
    2.4共价法
    共价结合法是细胞表面上官能团和固相支持物表面的反应基团形成化学共价键连接,从而固定微生物。该方法固定化微生物稳定性好，不易脱落，但限制了其活性，同时反应激烈,操作与控制复杂苛刻。常用于共价法的功能基团有氨基、羚基、琉基、轻基、酚基等。
    2.5 交联法
    交联法是利用双功能基团试剂或多功能基团试剂使微生物发生分子间交联而得到固定的一种方法。该方法生物反应活性损失大，且采用的交联剂大都比较昂贵，因此应用受到一定的限制。常用交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺。
    2.6无载体固定法
    细胞自絮凝形成颗粒的一种固定化细胞的方法。这种方法操作简单，微生物细胞的生理和生态环境不受外来物质的干扰，颗粒整体活性好，但内部结构疏松，结合不牢固。
 
    3固定化微生物技术在水产养殖中的应用
    3.1改善养殖水体环境
    由于环境污染日益严重，养殖水体的水质恶化，致使有害菌大量繁殖。在生产上，微生态制剂被广泛用来改善养殖水体环境。选作微生态制剂菌种的有光合细菌、硝化细菌、芽胞杆菌、双歧杆菌、酵母菌等，它们能吸收分解水中的氨氮、硫化氢、亚硝酸盐等有害物质以及鱼类产生的粪便和残饵，提高养殖水体中的溶氧，调节水体的pH值，从而达到改善养殖水体环境的目的。但是游离态的有益微生物在恶劣的环境中很难存活并繁殖为优势种群，容易被水流冲走、被其它生物所食，因此难以稳定地长期发挥作用。近年来，固定化细胞技术的兴起,为微生物的应用增添了新的活力。
    郑耀通，胡开辉（1999）采用净化模拟养殖水质试验表明：固定化光合细菌可显著提高氨态氮和COD的去除率，并能增加溶解氧。Hisashi等比较了PVA和海藻酸2种材料固定化光合细菌对鱼池水质净化与反硝化的效果，结果表明固定化PVA球比海藻酸盐固定化球的水质净化能力强。黄正等富集、培养硝化细菌污泥，选用PVA作为载体，添加适量粉末活性炭包埋固定硝化细菌污泥,处理养殖废水(COD=243 mg/L,NH4+—N= 45 mg/L)，处理24 h后COD去除率为74.9%，NH4+—N去除率达82.5%。Shan等利用固定化的硝化细菌去除对虾养殖池中高浓度的氨氮,能有效去除养殖池中的总氨氮量高达20 mg/L，即使投入的固定化颗粒密度较小，也能获得较高的总氨氮去除率。余林娟等（2004）以沙粒或沸石粉作为载体分别固定芽孢杆菌作为微生物治理剂,并将其应用于实验虾池和生产性虾池中,以NH4+—N和NO2-—N含量作为指标判断它们对虾池水体水质的影响和控制，结果表明此类新型的固定化微生物治理剂具有稳定的生物效应，持续发挥作用，对虾池亚硝酸盐有明显的去除控制效果。
    3.2提高鱼种运输成活率
    王立华（1997）通过密封鱼篓运输鲤鱼鱼种试验发现：运输鲤鱼鱼种过程中添加固定化光合细菌，可提高鱼种成活率，其鱼种成活率比游离光合细菌提高10.9%，比对照篓提高14%，显示了较好的运输效果。
    3.3提高鱼苗育种的成活率
    郑耀通，胡开辉（1999）经1个月的鱼苗饲养试验，固定化光合细菌组和游离光合细菌组鱼体重显著大于对照组，成活率也高于对照组，固定化光合细菌组效果最佳，不仅鱼体质好，活泼，个体较大且整齐，体色鲜艳。其主要原因是固定化光合细菌能高效净化水质，特别是能去除氨氮等有毒物质，从而减轻了对鱼体的毒害作用，使鱼体能维持正常的物质代谢。固定化光合细菌组优于游离菌组，前者不受流水和换水的影响，在使用前可清洗，消除了培养基影响水质的问题。王怡平（1999）研究发现固定化光合细菌在中华绒螯蟹人工育苗中也有重要的作用。
    3.4生态防病
    有益微生物被包埋载体固定化后，在微生物环境中占绝对优势，由于其高效去除有机污染物而抑制了有害异养菌生长，间接地起到了防治鱼病的作用。
 

                                                               编辑：王宇