国外一项新发现，可使对虾养成率提高到85%

     根据一份来自越南胡志明市的AquaMekong Shrimp Vet实验室和比利时Nutriad International公司联合撰写的报告显示，饲料添加剂有助于减轻早期死亡综合征对于对虾的影响。


    据悉，早期死亡综合征（EMS）在科研领域更为常见的名称是急性肝胰腺坏死病（AHPND）,这种新型的虾病目前集中爆发于中国、泰国、越南和墨西哥等对虾主要养殖地区。由于引起对虾发病的副溶血弧菌菌株的特异性，致使这种病原体很难从环境中根除，因此对于AHPND，亟需一种生物安全策略去抵抗目前EMS肆虐的情况。






    研究表明，在微生物的作用下，通过初期对亲体和幼体进行持续干预避免早期污染对防治EMS至关重要。为了控制弧菌发展在养殖过程中使用任何抗生素都是不可取的，因为一旦使用抗生素就意味着要承担产生生物抗性以及被立法者与消费者抵制的风险，因此如今的对虾产业正在寻求一种替代方式去调控生产过程中的微生物系统。


    其中，可持续调节对虾肠道微生物系统的方法包括使用益生菌、有机酸、酵母提取物以及其它可以使菌株产有益物质的天然化合物。这些化合物之间的协同反应将对对虾肠道产生有益作用，例如天然化合物可以强化益生菌系统，从而提高在生产过程中接种益生菌的效果。


    此外，富含促进肠道健康因子的功能性饲料能够每天为对虾肠道提供足够浓度的天然抗菌肽。这样类型的饲料在任何治疗EMS病症的方案里都是关键。值得注意的是，防治EMS的方法能否成功取决于用来对抗病原菌的肠道健康促进因子效力的大小。理想的饲料添加剂应该是热稳定的，这样饲料厂在后期加工时可以很方便地添加到饲料中。


    天然饲料添加剂的不同组合针对弧菌有不同作用机制，诸如使用直接杀菌剂、抑菌剂或者群体活性抑制剂等在低于MIC浓度（最小抑菌浓度）下，是处理EMS时最有效的组合。在现阶段的实验中，主要评估的是一种对实验室AHPND弧菌感染力减轻的效果，以及使用三种不同种类的健康饲料添加剂所表现出的具体效力，而主要检测的是这种弧菌对对虾消化系统的感染情况，同再次感染发生后2周之内对虾的死亡率。


实验情况


    此次富有挑战性的跟踪实验是在越南胡志明市的AquaMekong对虾实验室（MPA）中进行。实验人员在21天前，用前文提到的三种饲料添加剂（编者注：即后面提到的SANACORE、PHYTO和OAC）混合到对虾的食物中，用来饲喂南美白对虾。


    实验前的准备工作是，将12天大小的对虾（SPF，SIS亲虾）在生物安全系数极高的环境中培养45天到其重量达1-2g的时候可以转移到实验环境中。在实验开始的一天前，南美白对虾被转移到90L的培养箱内。每天都对试验箱中的对虾投喂其体重5%的实验饲料。值得注意的是，所有的实验水族箱都装备有牡蛎壳过滤器、通风装置并用塑料膜覆盖以减少被污染的风险。


    实验中，将混合有上述三种具有微生物抗性饲料添加剂的饲料和未添加任何其它成分的普通饲料进行比较发现：1、SANACORE是一种高效融合多种抑菌剂以及菌群抑制剂的天然抗菌化合物；2、PHYTO是一种植物性的抗菌混合剂；3、OAC是一种有机酸混合物。


实验方法


    MAP和亚利桑那大学的水产养殖实验室合作研发了多种极具挑战性的试验方法，通过模拟自然感染条件，来观察幼虾应对因副溶血弧菌引起的EMS/AHPND（感染主要是通过水媒传播以及同类相食）。


    在这项研究中，主要使用两个方法：一个是（细菌）水浸没法，另一个是直接注射（细菌）法。


    水浸没实验方法：使用胰蛋白酶大豆肉汤+2%的氯化钠溶液+副溶血弧菌菌株，在28℃的环境下培养18个小时之后，直接加入到罐中使整体溶液的光密度达到3.105个细胞/ml（译者注：OD600为3.105即细菌浓度已达到饱和状态）。


    直接注射实验方法：在TSB 培养液上接种LA37副溶血弧菌菌株并保温18个小时，加入20%的对虾饲料并在空气中干燥15分钟，最后为对虾直接注射这种处理过的饲料，饲料的重量大约在对虾体重的3%左右。

实验室的实验装置

    另外，设置对照组，对照组同样饲喂相同饲料，不同的是使用无菌TSB培养基来代替细菌悬浮液。在实验开始的一天前，设置0号实验组用于记录WSSV、TSV、EMS/AHPND以及IMNV等动物的亚健康状态，用于之后区别EMS引起的发病率及死亡率。每组实验中，在电镀到用于计数的不同媒介金属板上之前，琼脂培养基上的弧菌总数要在5日、10日、15日分别进行一次稀释，最后将实验对虾剥壳打成匀浆后并在盐水中连续地稀释。过程中，每天检查两次实验装置，发现死亡样品之后及时将其从实验装置中取出冰冻处理用于之后的PCR，要在每一个实验组中取出3个垂死的样本保存在AFA固定剂中，使用常规组织学方法处理，并最中PCR确认EMS/AHPND的病理真实存在。所有实验都结束之后，凡是仍然存活（无论活跃程度）的样本都算作该实验幸存样本。


结果与讨论


    经组织学分析表明，阴性对照组在整个实验过程中虾体都保持着EMS阴性状态。同时，在其它阳性实验组中则表现出了EMS病变症状。让人感到有趣的是，在所有EMS呈阳性的组里，实验开始5天和10天的两组对虾感染EMS严重，但是在实验开展15天的实验组里并没有发现很严重的EMS病症出现。这项实验结果表明了对虾有可能在感染了EMS之后重新恢复健康状态，但前提是它们可以在与EMS的对抗中幸存下来。


    实验中，阴性对照组中对虾的存活率高达91%，这表明在整个实验中所使用的对虾处于健康、营养良好的状态。除此之外，此过程里对虾死亡集中在实验进行到15天的时候，这是由于选择了毒性中等的弧菌菌株所致（图1）。

    图1：实验进行的15天内，样品对虾面临两种感染方式的威胁，具体程度如图，分别是阴性对照组（黄色），阳性对照组（红色）以及阳性组中饲料分别加入不同添加剂（SANACORE蓝色；PHYTO绿色；OAC紫色）。然而，在水浸没法感染实验中使用添加剂组的对虾死亡会减缓，但在直接注射感染法中，鲜有这种现象发生。阳性组中，水浸没法和直接注射法的存活率分别为15.6%和26.7%。


    图2：三种饲料添加剂中，在阳性对照组死亡率的基础上，相比较SANACORE的存活率最高，在水浸没和直接注射感染中虾的成活率分别为+107%和+62%；PHYTO仅在水浸没感染法中表现出较高的成活率，具体为+135%；OAC在两个不同的感染方式中成活率之间没有明显区别。 




   

 图3：图表显示的是实验中通过两种感染方式处理，三种不同的添加剂最终导致对虾消化系统中的弧菌总数。其中第0天显示的是实验开始前已经用不同的饲料喂养21天之后的样品数据。值得注意的是，同对照组相比，较低弧菌水平的样品组在21天的喂养中已经建立了稳定的吃食习惯。 

    该实验结果与来自受EMS影响严重的墨西哥、越南等地农场的田间试验结果一致，即饲料添加剂可以使对虾受EMS影响的成活率从60%-70%提高到85%。然而广大养殖户应该明白的是，饲料添加剂在解决EMS影响方面并不是绝对有效的方式，更多的需要做好养殖管理。