鱼贝类精子高效冻存实现车间化和自动化、规范化

    高效鱼类及贝类精子冻存项目这一高效冻存体系之所以能提高到工业化层面而不是机械地将数个小规模冻存进行叠加，归功于三个特征：车间化和自动化、规范化质量控制以及过程模拟分析。
　　
　　文/ 图 美国路易斯安那州州立大学农业中心水产研究站 胡轭
　　
　　精子冻存技术是一项在二十世纪中兴起的冷冻保存技术。此技术首先在畜牧牛的育种中产生了革命性的影响，使欧洲和北美绝大多数养牛场得以依赖冻存精子进行配种。收集、保存和交易有价值的种牛的精子已经具有每年数亿美元的全球化市场（图1）。与此同时，其它畜牧业动物猪、马、羊等，也在迅速发展和赶超这一技术。美国农业局下属的国家农业种质项目不仅保存着近50万冻存管的奶牛和肉牛精子，还有20万份冻存的猪精子和6万份山羊和绵羊的精子作为美国畜牧的基因资源备份。此外，关于马和鸡的精子冻存技术的研究和应用也是如火如荼。
　　
　　精子冻存技术给畜牧业尤其是优良品系的拥有者提供了一退一进两手策略：退，能备份已有的遗传性状；进，能交易和运输己有的遗传物质而获得其它感兴趣的遗传性状。正是这一退一进的灵活性，促成了覆盖全球的标准化冻存精子贸易网络以及每年2300万冻存管的巨大交易量。
　　
　　精子冷冻技术首次在鱼类上的实践是在二十世纪五十年代，和家畜的研究基本同时起步，但鱼类和贝类精子的冻存始终没有成为生产应用的主要技术之一。其主要原因在于水产养殖过去一直应用自然交配的育种方式。然而，出于对遗传性状的重视，科学家们想方设法去提高其保存效率。
　　
　　在过去的六十年内，对水产类生物精子的冻存研究以几何倍数增长，各国也在冻存技术的支持下陆续开始建设种质库保存和备份水生生物多样性。联合国粮农组织水产渔业部提出了重视水产遗传物质的纲要，法国国家水生动物冷冻库、墨西哥遗传资源中心、以及中国水产科学研究院国家渔业种质平台都是国家级资源库的成功范例。另一方面，医学和药学的发展带动下的模式生物鱼的扩大养殖和原有的实验室空间产生了冲突，欧洲和美国的很多模式鱼类中心已经采用精子冻存技术来节省空间并通过邮寄冻存样品来相互交流有研究价值的突变性状。
　　
　　然而，针对多样性保护的小规模冻存一方面不能实现规模化市场和生产的需求，一方面容易陷入对冻存步骤细节的过度考究而脱离了实际应用。而且，因为小规模的冻存成本高产量小，不能在实际生产中接受长时间的检测，更无法在实践中寻找自身的不足而进行进化升级。
　　
　　高效鱼类及贝类精子冻存项目在过去的十年里曾数次列为美国农业局科研基金项目，其中路易斯安那州州立大学农业中心水产研究院水产种质实验室是第一个实现鱼类及贝类高效冻存的研究机构。该项目主体由我在2012年完成，将自动化设备和工业化设备与冷冻实验技术结合，实现了质量稳定的大规模冻存，并在美国官方和私人养鱼场进行了多次实践，获得了稳定的收益。这一高效冻存体系之所以能提高到工业化层面而不是机械地将数个小规模冻存进行叠加，归功于三个特征：车间化和自动化、规范化质量控制、以及过程模拟分析。
　　
　　车间化和自动化是提高效率的第一步。这其中包括工作环境的选择、设备和工具选择、流水线设计。车间化保证了精子样品在加工处理过程中移动的顺畅，自动化降低了操作误差。目前被采用的自动化分装系统只有法国和德国有，但都使用0.5ml冻存管为基本容器。我们设计的高效冻存体系兼容了两套系统（图2），并采用美国需求量大的鱼种——蓝鲶鱼作为示范鱼种。整个系统已经实现了只用3个人工日产1000管的产量。这一产量已经和美国大规模杂交鮰鱼（斑点叉尾鮰母鱼和蓝鲶鱼公鱼杂交）育苗场的精子日使用量相一致。为了进一步证明冻存精子在实际生产中的功效，我们连续3年和大规模育苗场合作，使用冻存精子替代育苗场所需新鲜采集的精子的一半，其它育苗程序都保持不变。最终，同样体积的冻存精子和新鲜精子孵化出同等数目的苗。
　　
　　达到这个级别的孵化率也要归功于高效冻存的规范化质量控制。整个冻存过程是精密的细胞生化反应，因此各个细节都可能带入一定的影响因素，而因为细胞自我调节能力，累积的影响往往只在最后的产品中体现出来（较低的复苏率）。因此每一个步骤都需要把带入的影响减到最低。我们采用了工业工程的方法详细地制定了每一个步骤的规程，同时也设定了数量化的质量标准。同时，这套冻存体系采用了数量化质量控制方法（三倍标准差原理），时时监控重要生产环节，最大程度的保证质量，在同行中处于领先地位。
　　
　　介于高效冻存系统的设置需要因地制宜、因物种而变化，已建立的高效冻存系统由于人员经费的关系只能在较小的范围内进行调整。因此需要一种补充的分析手段来进行系统运行预测。我们借助ARENA（Rockwell Automation） 的可视化效果进行过程模拟（图3），把整个高效冻存搬上电脑屏幕。这套虚拟化的高效冻存系统可以检测人员增减、工时工量变化、生产线改良等各种假定，并给出时间、成本、产出等重要指标的统计分析。这些为进一步推广和建设新的高效冻存提供了强大的信息资源以供参考。
　　
　　鱼类的精子冻存已经在三文鱼养殖中起到举足轻重的作用。北欧的三文鱼养殖已经完全采用了精子冻存进行鱼卵孵化。优良的种鱼的精子采集之后被冻存起来，并运送到需要的种苗场孵化鱼卵。更进一步的是，由于三文鱼的鱼卵已经有了可靠的保存方法，三文鱼跨国公司可以将鱼卵和精子分别运送到加拿大和智利，并在当地进行孵化繁殖，减低了运输成本，使场地更靠近消费群体。
　　
　　以三文鱼为典范，目前，我们正在进一步推广高效鱼类及贝类精子冻存项目在水产尤其是育苗领域的应用（图4）。精子冷冻项目所需的关键技术支持是人工授精。目前几乎所有鱼类和贝类都能进行人工授精。在人工授精的前提下，使用高效鱼类及贝类精子冻存项目可以提供三个方面的优势：保种苗、促育苗和强化特种品系控制。
　　
　　保种苗：优良的品种是水产的关键。一旦有了好的养殖品种，育种站将投入巨大的精力和资源保护和维护种鱼。然而，维护活体的成本和风险都要远远超过维护冻存精子。有了冻存技术，带有优良品质的精子将从种鱼中收集并保存在液氮中。一旦出现极端情况种鱼死亡，冻存的精子可以通过简单直观的三代回交，产生拥有被保存品种93%遗传性状的新鱼（回交次数越多，新鱼和被保存品种越接近）。而高效冻存的自动化系统精确标记了每一个冻存管，方便精确查找和定位已保存的样品。
　　
　　促育苗：育种过程中因为选择方向的多样，往往会形成庞大的选择矩阵。由于资源和时间的局限，在选育工程中的有价值的个体可能会因为和主要选择方向不一致而被舍弃。同样的情况也可能出现在已有品种不尽如人意，鉴于场地限制而被舍弃。一旦个体被销毁，便没有办法再追溯和利用该品系的优良性状。
　　
　　而采用冻存技术辅助育种可以实时“备份”各个中间品系，一旦需要调整选择方向，可以方便地使用相应的冻存精子而不用从头开始。并且，在育苗过程中使用盛有同一亲本来源精子的冻存管可以方便地同时孵化数条母鱼的鱼卵，从而解决因选定的母鱼不能同时产卵或不在同一个地域而无法活体育苗的问题。
　　
　　强化特种品系控制：特种品系指的是用来杂交的高价值种鱼或是基因工程产生的“超级雄鱼”（YY雄鱼）或是用来产生三倍体后代的四倍体亲本（如牡蛎）。这些品系有着极高的经济价值，并常常牵涉到技术专利。因此，这些品系的活体都受到严格控制。使用冻存技术可以采集和保存精子，并将精子输送到其他的育苗站进行育苗。这样就避免活鱼的流失，同时精子接受方即使有了精子，在没有相应雌鱼的基础上，也不可能产生相应的特种品系。值得注意的是，品系的控制和转移也可以应用到一般鱼种上。尤其是当一个鱼种站需要关闭或转移时，及时冻存已有的种质资源可以方便转移和其他鱼种站的使用。
　　
　　高效鱼类及贝类精子冻存项目将改变传统观念中只有活鱼才能代表良种品系的思维，而建立品系和生殖细胞（精子）的直接联系，从而实现更为灵活有效的转移和管理。在互通有无的交易和交流中，使种苗场和农户最大程度地受益于各种优良的遗传性状，整体提高中国水产的生产力和竞争力。
　　
　

　　图3 虚拟蓝鲶鱼精子冻存过程在ARENA软件上的可视化界面

　　
　　图4 冻存精子辅助下的种鱼种苗管理