BHI344菌株对斑点叉尾鮰免疫机能的影响

    微生态制剂被摄入动物体肠道后，在复杂的微生态环境中与体内正常菌群汇合，显现出栖生、偏生、竞争或吞噬等复杂的关系，可以改变生物体内的微生物群落，促进宿主动物的健康（章剑，2000）。关于水产动物益生菌与其免疫力的关系已有一些报道（桂远明等，1994；黄永春和王盛伦，1997；Sirirat et al.，2000）。本试验通过利用从斑点叉尾鮰消化道中分离的BHI344菌株（根据鉴定结果属于Bacillus sp.）定量添加在饲料中投喂后，观察了对斑点叉尾鮰免疫机能的影响，探讨BHI344菌株的作用机理，为BHI344菌株的研究开发提供实验依据。

    1 材料与方法
    1.1试验鱼分组及饲养。
    试验地点选择在武汉市野芷湖渔场。网箱饲养的用斑点叉尾鮰购于。选择体格健壮、平均体重100g的斑点叉尾鮰，分养于水泥池中。水泥池的规格为2m×2m×1m。本试验利用从斑点叉尾鮰消化道中分离的BHI344菌株浓度的不同分为4组，B0组为不含BHI344菌株的基础饲料（购于通威饲料公司，为168#饲料），B1组、B3组、B5组为分别含有1.0×1011cfu/kg饲料、3.0×1011cfu/kg饲料、5.0×1011cfu/kg饲料的BHI344菌株的饲料。每组70尾。
    试验期间按试验要求分别投喂不同饲料，其中B1组、B3组、B5组投喂对应含BHI344菌株饲料28d后，改投与B0组相同的不含BHI344菌株的饲料。试验鱼进池后先暂养、驯养两周后，再开始正式试验。在整个试验期间，保持微流水。溶氧5~6 mg/L，pH 6.8左右。每日喂食两次（8:30-9:00，16:00-16:30），每日投饵量为鱼体重的3.0%~5.0%。
    1.2 试验饲料及加工。
    将购买的商品饲料（168#饲料）粉碎后，按需要量加入BHI344菌株；B0组则加入相等量的生理盐水。将其充分拌匀，用小型制粒机加工成直径为2.5mm的颗粒，于45℃下烘干，保存备用。
    1.3 吞噬原­的制备。
    将金黄色葡萄球菌接种在FWA培养基上，28℃培养36h，集菌，并用无菌生理盐水离心洗涤2次，制成菌悬液备用。然后在S.aureus悬液中加入终浓度为0.5%的福尔马林，28℃灭活24 h。将福尔马林灭活的S.aureus菌体，作为本试验中的吞噬原­。经­过平皿法证实此菌已被彻底灭活后，置4℃冰箱中保存备用。
    1.4试样收集。
    分别于投喂BHI344菌株前和投喂后的第4d、7d、14d、21d、28d及停止投喂BHI344菌株后的第7d、14d的上午进行试样收集。采用心脏取血和断尾取血，每组取6尾鱼。断尾取血后，将每尾鱼的血液分成2份：1份置室温1h，再置冰箱内4h，以2000r/min离心15min分离血清，供检测溶菌酶活性；另1份以肝素抗凝，供测定白细胞吞噬活性。心脏取血离心分离获得血液淋巴细胞，供测定淋巴细胞转化率。
    取斑点叉尾鮰前、中、后肠各一段约1cm长，立即放入Bouin氏液中固定，固定半天后，仔细修整，剪为0.1-0.2cm长的片段，经­石蜡包埋、切片、HE染色后，用于观察肠上皮内淋巴细胞。
    1.5白细胞吞噬活性测定。
    在0.25mL抗凝血中加入0.1mL用灭菌生理盐水调整为1×108cells/mL的S. aureus悬液，摇匀后置于28℃恒温水浴锅中，孵育1 h，每个血样做血涂片5张，自然晾干，甲醇固定，Giemsa染色2 h，水洗晾干后置油镜下观察计数，并按下式计算吞噬百分比（Phagocytic percentage，PP）和吞噬指数（Phagocytic index，PI）。 
    吞噬百分比（PP）=（100个白细胞中参与吞噬的细胞数/100）×100
    吞噬指数（PI）=被吞噬的细菌数/吞噬细菌的细胞数
    1.6血清溶菌酶活性测定。 
    1.61 菌液的制备：以溶壁微球菌（Micrococcus lysoleikticus，Sigma公司产品）冻干粉为底物，用1/15 mol/L，pH 6.4磷酸缓冲液配成一定浓度的悬浊液，用722型分光光度计于640 nm测定并调整其浓度，使透光率达30％-40％（OD640=0.3，菌浓度为4×106cfu/mL）。将此菌液作为测定溶菌酶活性的底物。
    1.62溶菌酶活性的测定：取0.1mL血清于小试管中，置28℃水浴锅中预热5min，然后加入1.8mL已预热的菌液，立即计时，至2min时加入2滴5mol/L KOH溶液以终止反应，立即用0.5 cm比色±­于640nm波长测其透光率T1％。取同样血清0.1mL于2滴5mol/L的KOH溶液中摇匀，28℃预热5min后加入1.8mL已预热的菌液，在同样温度下至2min时同法测定其透光率T0％。T1％£­T0％为透光率差值，即溶菌酶所致透光率的变化。再从标准曲线上查血清中溶菌酶活性。
1.63 标准曲线的制备：准确称取溶菌酶标准品（Amresco产品，20000u/mg），用pH 6.4，1/15 mol/L PBS配成1000μg/mL，临用时用PBS稀释成500μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL标准液，用0.1mL各种浓度的溶菌酶标准液代替血清样品，操作方法与以上测血清的相同。根据测得的不同浓度标准液透光率的变化值得到标准曲线：y=20×（8.963x£­22.362），可按此式计算血清样品溶菌酶活性。其中y表示溶菌酶活性（单位：u/mL），x表示反应前后浓度透光率差值。
    1.7 淋巴细胞转化率测定。
    斑点叉尾鮰血液中淋巴细胞的分离参照楠田等（1996）的方法进行。血液淋巴细胞转化率的测定参照陈昌福（1998）和唐玫（2001）的方法进行。用经­肝素处理的注射器，穿刺心脏采血。将血液缓慢加注在盛有淋巴细胞分离液的离心管液面上，3500 r/min离心10min，吸取其白细胞层，用RPMI-1640培养基离心清洗3次后，调整至1.0×106 cells/mL的浓度，作为淋巴细胞液备用。在96孔微量组织培养板的孔中添加0.09mL淋巴细胞液和0.01mL PHA液，对照组则添加0.01mL RPMI-1640培养液。在5%CO2培养箱中28℃培养66h后，于每孔中分别添加0.01mL MTT液，再培养4h，终止培养，小心吸去培养液，加入二甲基亚枫0.10mL，溶解由细胞代谢MTT而产生的蓝色沉淀，在722型分光光度计上（吸收波长为570 nm）测吸光值（OD570），以刺激指数（Stimulation index，SI）表示淋巴细胞转化率。 
    刺激指数（SI）=试验孔OD均值/对照孔OD均值
    1.8 肠上皮内淋巴细胞的观察与计数。 
    样品经­固定后，用各级乙醇脱水，经­二甲苯透明后，用石蜡包埋，切片（厚度约5um），苏木精和伊红染色（HE染色法），中性树胶封片，置显微镜下观察其肠上皮内淋巴细胞（iIEL）。分别在前肠、中肠和后肠的每张切片的3个不同区域内观察和计数肠上皮细胞和上皮内淋巴细胞（iIEL），计算100个肠上皮细胞段内iIEL的相对数量。 
    1.9 数据处理
    试验数据用STATISTIC6.0软件进行统计分析，组间差异采用Duncan’s多重比较，显著水平为0.05。

    2 结果与分析
    2.1 投喂BHI344菌株对斑点叉尾鮰白细胞吞噬活性的影响
    投喂BHI344菌株对斑点叉尾鮰白细胞吞噬活性的影响结果见表1。 

    投喂BHI344菌株前，B1组、B3组、B5组与B0组的吞噬百分比（PP）和吞噬指数（PI）均无显著性差异。投喂BHI344菌株后第4d，斑点叉尾鮰白细胞吞噬活性有些许增强，B1组、B3组、B5组的PP和PI均高于B0组。随着投喂时间的延长，B1组、B3组、B5组的PP和PI还有一定的上升。B1组、B3组和B5组PP分别在第14d、7d、7d达到最高值，为56.67%、65.63%、65.63%；B0组PP则为31.33%-46.88%。在停止投喂BHI344菌株后，B1组、B3组和B5组PP虽有不同程度的下降，但在第35d和42d时仍明显高于B0组。PI的变化趋势与PP不同。投喂BHI344菌株后，B3组、B5 组PI开始上升，分别在第14d、21d达到较高值，为3.06和3.31，并在停止投喂BHI344菌株后的第14d呈现第2次较高值，分别为3.99和4.12，高于B0组；B0组PI则为1.92-2.30。而B1组PI在试验期间与B0组基本无差异。
    2.2 投喂BHI344菌株对斑点叉尾鮰血清溶菌酶活性的影响

    投喂BHI344菌株对斑点叉尾鮰血清溶菌酶活性的影响结果见表2。投喂BHI344菌株前， B1组、B3组、B5组与B0组的血清溶菌酶活性并无显著差异。投喂BHI344菌株后第4d，B1组、B3组、B5组的溶菌酶活性稍微高于B0组。B1组、B3组、B5组变化趋势基本相同，均于第14d达到最大值，分别为64.90u/mL、92.70u/mL、94.28u/mL。停止投喂BHI344菌株后，B1组、B3组、B5组仍显著高于B0组。B3组和B5组在试验期间基本无差异；而B3组、B5组的溶菌酶活性均高于B1组。
    2.3 投喂BHI344菌株对斑点叉尾鮰血液淋巴细胞转化率的影响

    投喂BHI344菌株对斑点叉尾鮰淋巴细胞转化率（SI）的影响结果详见表3。投喂BHI344菌株前，B1组、B3组、B5组与B0组的淋巴细胞转化率（SI）并无显著性差异。投喂BHI344菌株后第14d，B1组、B3组、B5组开始与B0组呈现些许差异，分别于第28d、21d、21d达到最高值，分别为1.214、1.381、1.547。B0组SI则为0.641-0.941。停止投喂BHI344菌株后第7d，B1组与B0组无显著性差异；停止投喂后第14d，B1组、B3组、B5组与B0组间并不呈现显著差异。
    2.4 投喂BHI344菌株对斑点叉尾鮰肠上皮内淋巴细胞的影响

    HE染色结果表明：上皮内淋巴细胞为分散在分布于肠绒毛上的一群特殊淋巴细胞，一般位于上皮内细胞间隙、上皮细胞内以及基膜处，多数位于上皮细胞基底部，在各组鱼的前中后肠绒毛上均有分布，细胞较小，胞核大而圆，深染。不同的肠段，其iIEL数量也有所不同，后肠最多，前肠和中肠次之。
    投喂BHI344菌株对斑点叉尾鮰iIEL相对数量的影响见表4。从表4可以看出，投喂BHI344菌株前，B0组、B1组、B3组、B5组间均无显著差异。投喂BHI344菌株后第7d，B3组iIEL相对数量（37.52％）开始显著高于B0组（29.07％）；投喂后第14d，B5组iIEL相对数量（41.03％）开始显著高于B0组（28.14％）。B1组、B3组、B5组均在第21d达到最高值，分别为40.87％、47.34％、44.52％；B0组iIEL相对数量则为25.62％-32.44％。B1组除第21d外，基本与B0组无显著差异；停止投喂BHI344菌株后第14d时，B3组和B5组iIEL数仍显著高于B0组。

    3 讨论
    3.1 BHI344菌株对斑点叉尾鮰免疫机能的影响
    吞噬细胞担负吞噬胶质颗粒、衰老及死亡细胞和病原­微生物等抗原­物质的作用，是鱼类有机体抵抗疾病的一种方式。鱼类吞噬细胞的吞噬活性不仅受温度的影响（孟跃华等，1990；李静和陈昌福，1999），而且还受到饵料、免疫激活剂等的影响（吴志新等，1998）。溶菌酶是存在于许多鱼类的体表黏液、肠道黏液、血清和巨噬细胞中的一种水解酶。血清溶菌酶主要来自血液中，它能水解革兰氏阳性菌的细胞壁中粘肽的乙酰氨基多糖并使之裂解被释放出来，形成一个水解体系，破坏和消除侵入体内的异物，从而担负起机体防御的机能。鱼类溶菌酶的水平受鱼的种类、特定组织、饵料、pH值、温度甚至生殖周期等许多因素的影响（陈昌福和纪国良，1990）。一般认为，对白细胞吞噬活性和溶菌酶活性的测定可反映鱼体的免疫机能。
    在陆生动物中所进行的一系列实验表明，动物体内的益生菌群的存在可以增强动物自身的免疫力，其免疫指标如巨噬细胞、免疫球蛋白、抗体等都与益生菌群有着密切的相关性。近年来也有文献报道水产动物益生菌与其免疫力的关系（桂远明等，1994；孙舰军和丁美丽，1999）。桂远明等（1994）从正常鲤鱼肠道中分离出Jy10（节杆菌）和Jy13（乳杆菌）制成益生菌制剂投喂鲢，发现鲢白细胞吞噬率与吞噬指数、巨噬细胞吞噬率与E玫瑰花环形成率均高于对照组，且受病菌攻击后，试验组的成活率和特异性抗体效价均明显高于对照组。孙舰军和丁美丽（1999）把光合细菌拌入饵料投喂中国对虾，22天后发现虾体酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌和抗菌活力分别比对照组高102.2%、22.1%、53.4%和14.0%，血细胞数目高出67.2%。王宏田和张培军（2000）发现用含有大马哈鱼生长激素基因的重组酵母菌可以增加牙鲆血清蛋白的含量，增加牙鲆血清中溶菌酶和抗蛋白物质的活性。本试验发现浓度为1.0×1011cfu/kg饲料、3.0×1011cfu/kg饲料、5.0×1011cfu/kg饲料的BHI344菌株均能些许提高斑点叉尾鮰白细胞吞噬活性和血清溶菌酶活性。
    赵明É­（2002）认为，使用微生态活菌制剂后，4d-5d开始发挥作用，7d-10d效果最好。王雄等（2004）在微生态制剂对银鲫血清溶菌酶活性研究中发现，投喂微生态制剂后第4d，试验组即与对照组呈现显著性差异，第14d达到峰值。本研究结果与之基本相符，B1组、B3组、B5组的白细胞吞噬活性和溶菌酶活性均从第4d起即高于B0组，并于7d-14d达到最高值。说明BHI344菌株能迅速且明显增强斑点叉尾鮰的白细胞吞噬活性和溶菌酶活性。而本试验中，BHI344菌株对斑点叉尾鮰淋巴细胞转化率的提高作用相对则缓慢些，B1组、B3组、B5组在投喂BHI344菌株14d才开始显著高于B0组，B0组、B1组、B3组、B5组均于第28d达到最高值。
    具有适应性免疫系统（adaptive immune system）的动物一个主要特征是其免疫系统中存在淋巴细胞和免疫球蛋白，鱼类是具有这种免疫系统最原­始的动物（Estepa and Coll，1992）。离体培养淋巴细胞受到特异性和非特异性有丝分裂原­的刺激后，可转化为淋巴母细胞，由于这种转化是与机体的免疫机能有关，因此，淋巴细胞转化率常被用作评价机体细胞免疫功能的指标（王世若等，1996）。目前，对淋巴细胞转化率的测定在人类和畜禽内研究的较多，在水产动物中则少见报道。陈昌福（1998）、李亚南（2000）、曾慷等（2001）、丁光等（2003）、乌日琴等（2003）曾通过3H-TdR掺入法、形态学检查法、MTT颜色反应法分别对关于PHA、SPA、ISKNV、ConA、LPS对斑点叉尾鮰、鳜、鲤、牙鲆的外周血及免疫器官中的淋巴细胞转化的影响进行了研究，说明淋巴细胞转化的高低与试验对象、取样组织或器官、刺激物种类、温度以及试验对象是否应激有关。在本试验所采用的BHI344菌株浓度范围中，发现随着BHI344菌株的浓度逐渐增大，斑点叉尾鮰血液淋巴细胞转化率也随之上升。但停止投喂后14d，B1组、B3组、B5组SI与B0组之间无显著差异。这是否与所用BHI344菌株浓度或者鱼的种类有关，尚需进一步研究。
    肠道黏膜不仅是消化吸收营养物质的场所，而且还可识别入侵的有害微生物以及被肠黏膜上皮吸收的异己物质并加以排除，因此，肠道黏膜免疫是机体防止感染的第一道防线。黏膜免疫系统中有3类性质独特的免疫细胞：M细胞、上皮内淋巴细胞（iIEL）、肠黏膜上皮细胞，其中iIEL位于肠上皮细胞间，由于它的特殊定位，使它成为第一个与黏膜表面抗原­接触的免疫细胞，它的抗原­识别途径和激活特点及其相关分子，iIEL在黏膜免疫耐受与黏膜免疫应答激活及黏膜免疫防御中的作用是黏膜免疫领域当今研究的热点。有研究表明肠上皮内淋巴细胞可随动物的种属、年龄及食物等多种因素的变化而有所不同（Fujifashi et al.，1994），还可能参加黏膜免疫应答（谢遵江­等，1997）。Asai K等（2000）报道，在上皮中，15%的细胞为淋巴细胞，是黏膜免疫系统中最先接触抗原­的免疫活性细胞。它不但参与免疫反应，而且通过伪足与上皮细胞接触，加速上皮细胞再生，所以在肠道黏膜中起重要的免疫屏障作用。本试验中，浓度为3.0×1011cfu/kg、5.0×1011cfu/kg饲料的BHI344菌株能提高斑点叉尾鮰iIEL的相对数量，有利于增强肠道的免疫屏障和机械屏障功能。
    3.2 BHI344菌株的营养与免疫
    营养与免疫的关系研究已成为动物营养研究中的一个重点，因为动物的免疫状态对动物的生长有很大影响，而机体的免疫状态又受多种营养因素影响，动物消化吸收的蛋白质、能量、矿物质元素、维生素等都对免疫功能有很大影响。而微生态制剂的添加可能也会影响以上各种营养成分的消化和吸收，最终影响机体免疫状况。
    已有不少研究表明BHI344菌株能够分泌大量胞外酶，参与饲料的降解、消化，提高饲料利用率（Kazuaki et al.，1999），并且芽孢杆菌代谢产生的酶对宿主生产性能或生理生化指标产生明显影响（Kerovuo et al.，1998），且在生长繁殖过程中能够产生乙酸等挥发性脂肪酸，降低肠道pH值；产生B族维生素和维生素C，为动物提供维生素营养（张民和刁其玉，2003）。芽孢杆菌还能促进肠道相关淋巴组织处于高度反应的“准备状态”，同时使免疫器官发育加快，免疫系统成熟快而早，T、B淋巴细胞数量增多，动物体液和细胞免疫水平提高（Inooka et al.，1986）。研究显示，微生态制剂中许多有益细菌的细胞壁具有免疫活性，如：乳酸杆菌的肽聚糖（孟凡伦等，1998）、双岐杆菌的细胞壁粘肽、芽孢杆菌的细胞壁成分（Sekine，1985）等，这类物质都具有刺激机体免疫系统，非特异性地提高动物免疫功能的作用。而关于芽孢杆菌的有效成分如脂磷壁酸和肽聚糖、细胞糖蛋白等物质与鱼类免疫功能间的关系以及这些物质具体生物活性的定性和定量研究，活性物质使用的途径及使用时间等方面的研究尚需进一步探讨。

    4 小结
    4.1  浓度为1.0×1011 cfu/kg饲料、3.0×1011 cfu/kg饲料、5.0×1011cfu/kg饲料的BHI344菌株均能些许提高斑点叉尾鮰白细胞吞噬活性和溶菌酶活性，上调斑点叉尾鮰非特异性免疫机能，其中以B3组和B5组效果更明显；
    4.2  投喂BHI344菌株后14d-35d时，B1组、B3组、B5组的SI有所升高，但停止投喂BHI344菌株14d时，B0组、B1组、B3组、B5组的SI并无显著性差异；
    4.3  当BHI344菌株在饲料中添加浓度为3.0×1011 cfu/kg饲料和5.0×1011cfu/kg饲料时，斑点叉尾鮰iIEL的相对数量些许增加，斑点叉尾鮰肠道的免疫屏障和机械屏障功能得以增强。
综上所述，BHI344菌株能些许增强斑点叉尾鮰的白细胞吞噬活性、溶菌酶活性及iIEL的相对数量，增强斑点叉尾鮰的免疫机能。其中，当BHI344菌株浓度为3.0×1011 cfu/kg饲料，投喂时间为14d时，斑点叉尾鮰免疫机能活性上升较大。