草鱼3种不同类型肝损伤模型的初步建立

中国水产门户网报道   腾氏传媒－－《内陆水产》９月刊
文/ 武汉中博水产生物技术有限公司 张生元 艾桃山 喻运珍 刘堂水 邹金虎

肝脏是水产动物体内最大的实质性器官，结构与功能异常复杂，易受多种病原-体、毒物及免疫病理所累及。实验性肝损伤模型是实验和临床假说的基础，它的建立为探知肝脏疾病的病因、病理生理、疗效判断、疫苗开发提供有力的工具。

目前关于试验性肝损伤动物模型的研究主要集中于肝损伤动物模型分类、造模方法、检测生理生化因子等，而就草鱼肝损伤模型的具体组织病理学变化尚未明确的描述和报道。而本研究的目的也正是试图初步建立水产上常见3种不同类型的试验性肝损伤动物模型，从而为草鱼试验性肝损伤动物模型的进一步深入研究提供基础资料和参考依据。

一、材料和方法

1.材料：试验草鱼健康、强壮，体长(11.0 ± 2.0) cm，体重 (13.0 ± 2.8) g 购自武汉市汉南农场。实验草鱼在水族箱中驯养7 d以上，实验前1 d停止投饵，选择身体健康、反应灵敏、大小基本一致的随机分组。
2.试剂：晶体硫酸í-纯度99% ，批号 20070301 成都五环高欣化学试剂厂生产；40 %辛硫磷乳剂，江-苏利特化工有限公司生产，批号 20070401；喹乙醇，333江-苏南通醋酸化工厂兽药分厂生产，纯度98% ，批号：20070201。
3.试验条件：水为曝气24h的自来水，水温（24±2）℃，pH值6.8，溶氧量6 mg/L。试验在58 cm×38 cm×52 cm的水族箱中进行。
4.试验方法：试验期间每24 h更换实验液，全天充气。为防止饵料影响，试验期间不喂食。每浓度组放草鱼10尾，在曝露的过程中观察它们的行为、中毒症状、死亡效应。中毒后，多次刺激无反应判断为个体死亡，从水中捞出。记录各组鱼的24 h、48 h、96 h的死亡数，计算平均死亡数，转换成概率单位。用直线内插法，以浓度对数为横坐标，死亡率概率单位为纵坐标，求出各自的半数致死浓度（LC50）以及由公式E = 96 h LC50×0.1，求安全浓度。

5.肝脏组织病理切片显微结构观察：将各组试验鱼肝脏取l cm ×l cm×0.5 cm大小肝组织用波恩氏液固定，按病理学常规进行酒精梯度脱水后制备成病理组织学切片标本，HE染色后在光学显微镜下进行肝脏病理组织学观察拍照。

二、结果

1.硫酸í-浸泡试验结果：硫酸í-对草鱼24 h、48 h和96 h的半数致死浓度LC50分别为1.68 mg/L、1.24 mg/L、0.78 mg/L。安全浓度为0.078 mg/L。急性试验鱼死亡数和死亡率统计详见表1。

2.辛硫磷注射试验结果：辛硫磷对草鱼24 h、48 h、96 h半致死质量浓度分别为15.44 mg/L、8.98 mg/L、5.94 mg/L，安全质量浓度为0.594 mg/L，急性试验鱼死亡数和死亡率统计详见表2。

3.喹乙醇口灌试验结果：在本实验中，96 h内各组草鱼体况良好，均无一例死亡，再连续观察96 h，在各个试验组中，草鱼仍然没有出现不良反应和死亡。活体解剖，内脏各器官正常，说明草鱼对喹乙醇的敏感性比较低，使用低剂量的喹乙醇不会出现明显的毒性。

4.肝组织光镜观察：硫酸í-对照组：光镜下可以看到的草鱼肝脏以中央静脉为中心向四周排列，呈索状，肝细胞呈多角形，边缘清楚，细胞核位于细胞中央，肝细胞索之间有窦状隙，内有内皮细胞及枯否氏细胞，但光镜下区分不清（附图 1）。

硫酸铜模型组: 光镜下可以看到肝细胞肿胀，大部分出现颗粒性变性、空泡变性；汇管区有炎性细胞浸润；中央静脉有淤血现象，大部分肝细胞变性坏死，细胞核消失（附图 2）。

辛硫磷对照组：肝小叶结构清晰，肝细胞索以中央静脉为中心，向四周呈放射状排列，索窦比例正常；肝细胞界限清楚，细胞核位于细胞中央，汇管区未见纤维组织增生（附图 3）。

辛硫磷模型组：肝结构紊乱，出现广泛的肝细胞脂肪变性、空泡变性和弥散性的肝细胞坏死，有的只残留细胞核；坏死区域纤维组织增生（附图 4）。

喹乙醇对照组：光镜下可见肝小叶结构清晰，肝细胞索以中央静脉为中心，向四周呈放射状排列，比例正常；肝细胞界限清楚，细胞核位于细胞中央，汇管区未见纤维组织增生（附图 5）。

喹乙醇模型组：肝细胞结构基本正常，不见严重的脂肪变性或水泡变性。细胞核圆形或卵原-形，位于细胞中央，核染色质，较浓，核仁不清晰，细胞质丰富均匀，含有粒状或嗜碱性物质，只有极少数淋巴细胞浸润（附图 6）。


三、讨论

在水产上，建立试验性肝损伤模型对于研究水产动物肝损伤的发生机制及筛选合适的保肝护肝药物具有重要的意义。硫酸í-是水产上用得最为广泛的水产药物之一，但由于使用不当引起的水生动物中毒事件时有发生，本文的研究也表明使用浓度为0.077是较安全的，超过这个浓度长时间就会引起对肝脏的损伤，甚至引起鱼类的死亡。辛硫磷是有机磷制剂，与其它有机磷制剂相比较具有化学性能不稳定，降解速度快，在鱼体内残留不明显等特点，在水产上得到了广泛的应用，部分地区渔农甚至用辛硫磷来清塘，本研究也表明辛硫磷对草鱼是有一定毒性的，不同的水产动物对辛硫磷的敏感性不同。通过本试验也表明口灌喹-乙醇对草鱼的毒性是比较低的，因为没有找到口灌喹-乙醇的96 h半数致死剂量，没有出现死亡现象。因此可以推测使用低剂量的喹乙醇对草鱼进行口灌具有明显的毒性是欠妥的，短时间使用低剂量的喹乙醇不会对草鱼产生明显的毒性。

在试验开始后，部分高浓度硫酸铜、辛硫磷组出现症状，鱼体逐渐失去平衡，侧游、腹部向上漂浮在水中，时而全身剧烈震颤，在水中翻转、横冲直撞，最后沉入水底，全身轻微颤抖、呼吸困难、严重者窒息死亡。这表明硫酸铜-、辛硫磷损伤了鱼的呼吸系统和神经-系统，从而影响到其他器官如肝脏的代谢功能混乱，加速鱼体的快速死亡。

在临床上水产动物肝损伤之后，外观表现为土黄色，身体短，肚子大，打开腹部，内脏团脂肪多，肝脏有油质的感觉，放入水中，有比较多的油花，有时整个肝脏可以漂浮在水上，而不能沉入水下，病理检查可见肝脏浑浊肿胀，水样变性，脂肪变性或肝细胞中心性坏死，炎症细胞浸润，生化指标还可见血液中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著升高。