水产动物疾病快速诊断技术的发展与应用

中国水产门户网报道自改革开放以来，我国渔业得到了快速发展，水产品产量连续十几年位居世界首位。2008年，我国水产品出口额首次突破100亿美元，总额达106亿美元，占农产品出口总额（405亿美元）的26.2%，继续位居大宗农产品出口首位。然而全国水产技术推广总站病害监测报告指出，我国水产养殖品种繁多，病害发生种类、综合发病多，发病时间长，流行面积广，病害控制难度大，死亡率高，经济损失大。危害我国水产动物的病害主要是细菌性疾病、病毒性疾病、寄生虫性疾病和真菌性疾病，其中细菌性疾病在各年病害暴发病例中所占的比例最大，藻类疾病和不明原因的疾病所占比例相对较少。2004-2006年，我国水产动物病害监测到的疾病分别有126、207和214种，造成的经济损失分别是151.44、110和115.08亿元。
    造成水产动物病害暴发和流行的因素有很多，然而作者认为，如果养殖业者在病害暴发流行的早期便能对病害进行诊断，同时加上各种得当的防治措施，病害造成的经济损失可以降到最低。为了使快速诊断技术在水产动物疾病中得以普及，本文围绕不同类型的快速诊断技术展开阐述，期望能为水产养殖从业人员带来帮助。
一、简易快速诊断技术
    1、眼观快速诊断技术
    简易眼观快速诊断技术是一种简单而易推广的技术。这种技术既不需要高端仪器，也不需要昂贵的费用，就可实现对常规疾病的快速诊断，广受水产养殖一线群众的推崇。一般情况下，人们往往通过简单的口述，将水产动物的各种疾病诊断要点进行传授。这种快速诊断技术仅局限于对常见的、具有特征性症状的水产动物疾病的诊断。
    （1）根据体表症状的快速诊断法
    一般情况下，体表充血、发炎、鳞片脱落则多为赤皮病；若病鱼仅鳃盖或鳍条基部充血，皮肤充血不明显，撕开表皮发现肌肉呈充血状或块状淤血则为出血病；病鱼腹部膨大，肛门红肿呈紫红色，轻压腹部有黄色黏液流出则多为肠炎病；尾柄及腹部两侧有火烙样的红斑或表皮腐烂呈印章状则为打印病；体表生有棉絮状的白色物则为水霉病；体表黏液较多并有小米粒大小、形似臭虫状的虫体为鲺病；体表有白色亮点，离水两小时后亮点消失则为小瓜虫病；体表有白色斑点，白点之间有出血或红色斑点则为卵甲藻病；部分鳞片处发炎红肿，有红点并伴有针状虫体寄生则为锚头鳋病；鱼苗、鱼种成群在池塘周边或池水表面狂游，且头部充血呈红点，死亡多且迅速，一般为车轮虫病；病鱼尾柄表皮发白则为白皮病；病鱼在水中头部或嘴部明显发白，离水后又不明显的为白头白嘴病；鱼下唇突出呈簸箕口状则可能为池塘中常缺氧浮头引起的；病鱼眼睛突出，且鳞片松立，一般为池塘中有毒所致；鱼体呈弯曲状可能是由于营养不良或有机磷中毒所致，营养不良性疾病属于慢性疾病，而有机磷中毒则为急性中毒性疾病，生产上根据经验容易将两者区别诊断。
    （2）根据鳃瓣症状的快速诊断法
    打开病鱼鳃盖，检查鳃有无异样，正常的鳃丝整齐、紧密、呈鲜红色。鳃丝腐烂发白、尖端软骨外露，并有污泥和黏液，则为烂鳃病；鳃丝因贫血而发白，很可能是鳃霉病或球虫病；鳃丝末端挂着像蝇蛆一样的白色小虫则为中华鳋病；鳃部浮肿，鳃盖张开不能闭合，鳃丝失去鲜红色呈暗淡色则为指环虫病；鳃丝呈紫红色，黏液较少则可能为池塘中缺氧引起泛池所致；鳃丝呈紫红色，并伴有大量黏液则应考虑是否为中毒性疾病，如过量使用有机氯消毒剂时这种现象较常见。
    （3）根据肠道症状的快速诊断法
    剖开病鱼腹部，检查肠道，正常鱼的肠道中充满食物或粪便，肠壁呈肉红色。若肠道全部或局部出现充血，肠壁不发炎者为出血病；充血发炎且伴有大量黄色黏液则为肠炎病；前肠段肿大，但肠道颜色外观正常，肠内壁含有许多白色絮状物小结节则为球虫病或粘孢子虫病。
    2、显微镜检快速诊断技术
    简易显微镜快速诊断法，即应用普通显微镜对水产动物进行疾病的检查和诊断。这种方法在水产养殖生产第一线的应用最为广泛，是根据目检时所确定下来的病变部位，作进一步的诊断，常用于对病鱼的体表、鳃、肠道、眼、脑等部位常见的寄生虫性病原进行快速诊断。其主要判断依据是虫体的形态特征和虫体寄生部位。
    （1）体表快速镜检法 
    在发病鱼体表疑似病变部位上取适量组织和黏液均匀涂布于载玻片上，再滴加一滴无菌生理盐水，盖上盖玻片，于显微镜下观察，原则是先以低倍镜观察，再以高倍镜观察。体表常见的寄生虫种类主要有车轮虫、小瓜虫、斜管虫、鱼波豆虫、钩介幼虫、粘孢子虫等。体表镜检时，一般每个部位至少检查两个不同疑似位点。
    （2）鳃丝快速镜检法 
鳃丝常见的寄生虫主要有指环虫、三代虫、隐鞭虫、粘孢子虫等。诊断时，用镊子取一小部分鳃丝和黏液置于载玻片上，然后进行显微镜下诊断。
    （3）肠道快速镜检法
    肠道常见的寄生虫主要为毛细线虫、艾美虫、粘孢子虫等，诊断时，用镊子取适量前肠壁黏液置于载玻片上，然后进行显微镜下诊断。
    （4）眼部快速镜检法
    如果发现发病鱼的眼睛浑浊，晶状体模糊时，可将病鱼整个眼球晶状体取下，置于载玻片上镜检。如果见到双穴吸虫囊蚴则可定为双穴吸虫病。
    （5）脑部快速镜检法
    如果发现鱼发生疯狂病（可根据经验判断），可将病鱼脑腔剖开，仔细观察在脑旁拟淋巴液处是否有白色的粘孢子虫孢囊。若有，可用镊子将孢囊取出置于载玻片上压碎，显微镜下检查时可以见到许多孢子，即可确诊。
二、选择性培养基（Selective medium）快速诊断技术
    利用不同的培养基特定成分和培养条件，以抑制多数细菌，而只利于某一种或某一类细菌生长的培养基，即为选择性培养基。选择性培养基配制容易，使用方便，可作为基层实验室日常诊断的方法之一。选择性培养基具有操作简单、结果可靠等优点，一般情况下，24-48h内即可得出诊断结果，然而该系列方法仅局限于对细菌性病原的选择性诊断，不适用于对寄生虫性和病毒性病原的诊断。
    1、 Rimler-Shotts培养基
    Rimler-Shotts培养基用于鉴别腐皮病病原嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）。从病鱼病灶、肝、肾等内脏分离病原菌，接种于Rimler-Shotts培养基，在37℃培养20-24h后，如菌落为黄色，则病原为嗜水气单胞菌。其它颜色，如绿色、黄绿色、黄色菌落中央有黑点等，则是其它细菌。使用选择性培养基时，培养温度和时间很重要，如杀鲑气单胞菌在培养温度低于37℃ 时，产生的菌落特征与嗜水气单胞菌相似。1973年，Shorts和Rimler用Rimler-Shotts培养基，从水产动物和水体分离的109个菌株中进行嗜水气单胞菌鉴定，其结果准确率达94％。
    2、EIM培养基（Edwarsiella ictaluri medium）
    EIM培养基是专门用于分离和鉴别一种严重危害斑点叉尾鱼回的肠杆菌——鱼回爱德华氏菌，它能抑制多数鱼类病原菌和真菌的生长。在25℃培养48h后，E.ictaluri菌落呈绿色、半透明、直径大小为0.5-1.0mm；而若菌落呈褐色、褐绿色、红色、黄绿色，且直径大于2mm的，则为其它细菌。因此根据菌落的颜色及菌落大小可实现快速诊断。
    3、优化的Shieh 培养基
    Decostere 等人发现，妥布霉素对柱状黄杆菌具有较少的抑制作用，而对其它鱼类病原菌则有较强的抑制作用。因此，他通过在Shieh培养中添加妥布霉素（1µg/mL），配制了对柱状黄杆菌生长具有选择性的优化培养基。将分离的病原接种于优化的Shieh 培养基，30℃培养24h后，柱状黄杆菌能在培养基上生长，而其他细菌则几乎不能生长，因此该优化的培养基可用于对柱状黄杆菌的选择性快速诊断。
三、免疫学快速诊断技术
    免疫学快速诊断技术是一项特异、敏感和简便的技术，广泛应用于许多领域，尤其在生物医学的理论研究和临床诊断方面更是发挥了不可替代的作用。其主要包括血清凝集试验，免疫荧光抗体和免疫酶标技术在水产动物疾病诊断上的应用具有灵敏度高、特异性强、定位准确和应用广泛等优点。
    1、凝集试验
    （1）血清凝集试验
    颗粒性抗原与相应抗体在适当条件下发生反应，出现肉眼可见的凝集小块，称为直接凝集反应。将已知的抗体直接与待检的颗粒性抗原物质（如细菌、立克次体、钩端螺旋体、红细胞等）混合，在有适当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应无凝集物出现，即为阴性。血清凝集试验属定性试验。其操作过程如下：取洁净载玻片一张，用移液器取标准阳性诊断血清10µl，滴加于载玻片的一端，另端则滴加生理盐水10µl，做对照。然后用铂耳环钓取少许待检细菌，置生理盐水滴中缓慢混匀，再将铂耳环灭菌后冷却，钓取少许待检细菌置于血清滴中缓慢混匀。在3-5min内，血清滴若出现明显可见的凝集块，液体变为透明，盐水对照滴仍均匀混浊，凝集反应结果为阳性，说明待检细菌为阳性。该方法操作简单、诊断快速、结果可靠，适用于有条件制备阳性血清的实验室或已经标准阳性血清的单位使用。
    （2）血凝试验和血凝抑制试验
    何福林等（2002）指出，草鱼出血病病毒具有凝集鸡红细胞的能力，特异性抗血清能有效地阻挡此种凝集, 血凝试验和血凝抑制试验两种试验结合应用，能对草鱼出血病病毒和相应抗体进行定性与定量检测，试验要求的温度、酸碱度、红细胞种类等条件较易操作，各毒株间的血凝特性无明显差别，加之试验操作简便、反应快速、特异，尤其是对醛化红细胞具有很强的凝集能力，能快速诊断草鱼出血病。
    2、免疫荧光抗体技术
    免疫荧光抗体技术以荧光素为标记物，与已知抗体结合作为标准试剂，用于检测未知抗原，可在荧光显微镜下呈现荧光的特异性抗原抗体复合物及其存在部位。这项技术将免疫反应的特异性、灵敏性与显微镜技术的精确性相结合，是现代标记免疫检测的重要方法之一。殷战等（1994）应用此技术观察感染鲢鱼组织中的病原菌。夏春等（1998）制作了６种兔抗中国淡水鱼主要病原菌的纯化抗体，用免疫荧光抗体法与各病原菌以及来源于水环境和鱼体分离菌发生反应，表明此法能用于检测中国鱼类病原菌的并发、继发和混合性感染。王军等（2002）建立了大黄鱼病原溶藻弧菌的免疫荧光抗体检测方法，用于已感染发病或已感染未发病大黄鱼的快速检测。徐宋娟等（2004）应用免疫荧光抗体技术（IFAT）和标记链亲和素-生物素（LSAB）免疫组化法对患淋巴囊肿病牙鲆的10种组织进行了检测，发现体表有囊肿症状病鱼的胃、肠、鳃和表皮组织内有淋巴囊肿病毒存在；体表未见囊肿症状病鱼的胃、肠和表皮组织内也检测到了病毒，说明此免疫技术可以应用于牙鲆淋巴囊肿病的检测与诊断。张利峰等（2008）用制备的SVCV单抗，运用间接免疫荧光抗体技术（IFAT）对SVCV欧洲株和亚洲株感染的鲤鱼上皮瘤细胞进行检测，结果表明，应用该单抗可以检测出SVCV的欧洲株或亚洲株，不会造成漏检现象。而目前间接免疫荧光（IFAT）这两种快速诊断SVCV的方法已基本上解决了SVCV快速检测的基本要求。
    3、免疫酶标技术
    免疫酶标技术是利用抗原-抗体反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性，达到在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的部位的目的。其中，酶联免疫吸附试验是免疫酶标技术中最具特异性、敏感性、结果易于检测等特点的一种方法，近年来被广泛用于水产动物疾病的诊断。叶雪平等（1989）应用此法检测出草鱼出血病病毒抗原。江育林等（1990）检测了虹鳟的传染性胰脏坏死病病毒。Snow（1999）等建立出血性败血症病毒（VHSV）的ELISA检测方法，用来检测感染的大菱鲆，实验结果对于大菱鲆的HVSV感染的防治有重要的参考价值。王军等（2001）建立了网箱养殖大黄鱼病原菌－副溶血弧菌酶联免疫吸附法。杨鸢劼等（2005）制备了鳗弧菌B-11菌株的兔抗血清，并应用间接酶联免疫吸附法能检出1.5×10­-5个/m1浓度的B-11菌株，对患病鱼体的组织培养物鳗弧菌进行检测，呈现出明显的阳性反应，将此方法进行改良制备成商品试剂盒可对鳗弧菌进行快速，准确诊断，同时试剂盒的开发也具良好的应用前景。
四、分子生物学快速诊断技术
    随着分子生物学技术在水产领域的广泛应用，分子生物学技术已经体现出极高的应用价值和经济价值。它对解决水产业的技术难题、开创新的领域、改造产业的传统模式起着十分重要的作用。包括我国在内的许多国家都在大力研发与水产业有关的分子生物学技术，并着力于开发新的优良养殖种类、培育高产抗逆的良种以及探寻检测和防治病害的新技术、新方法等。因此应用分子生物学技术进行水产养殖品种的疾病诊断领域具有强大的发展潜力。
    1、单克隆抗体技术
    单克隆抗体是由一个抗体产生的细胞与一个骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞，经无性繁殖而来的细胞群产生。它与常规血清抗体相比，具有特异性强、亲和性一致、能识别单一抗原决定簇、且容易制备等特点，已成为生物工程学的重要组成部分。Arkush等（1992）制备7种斑点叉尾鱼回病毒CA8O一5株的单克隆抗体，采用中和试验及直接荧光抗体等方法，发现了CA8O-5株与其它几株的抗原性差别。黄健等（1995）应用单克隆抗体酶联免疫技术检测对虾皮下及造血组织坏死病的病原及其传播途径。战文斌等（1999）应用单克隆抗体的荧光抗体方法观察白斑病毒在日本对虾体内的感染增殖。王亮等（2004）成功获l8株抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体，并通过保持细胞系重复获得相同的抗体。而今，单克隆抗体技术已在水产动物病原体检测中得到了广泛应用，如应用于诊断海湾扇贝的鳃立克次体、鱼类及牡蚜相结合的淋巴细胞病毒、鲑鳟红嘴病及疖疮病、鳗弧菌、斑点叉尾鱼回病毒、鱼病毒性出血败血病毒、嗜水气单胞菌败血症等。
    2、PCR技术
    PCR技术又称DNA体外扩增技术，它是利用体外酶促反应合成特异DNA片段的一种方法，典型的PCR由高温变性模板，引物与模板退火，引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。PCR诊断技术可以应用于对细菌性病原、病毒性病原、寄生虫性病原等的快速诊断，其关键在于特异性引物的设计。梁万文等（2007）根据NCBI公布的鱼回爱德华氏细菌序列, 设计了一对特异性诊断引物CM3/CM4, 对鱼回爱德华氏细菌特异基因片段进行PCR扩增试验, 扩增到与预计大小相符的276bp爱德华氏菌特异性片段, 可以检测出病鱼脑、肝、肾及脾中的病原菌。余晓丽等（2008）根据嗜水气单胞菌16Sr RNA 基因序列, 设计并合成一对特异性引物, 用PCR 方法对从病死鲢鱼体内分离到的一 株嗜水气单胞菌进行扩增。该引物能扩增出680bp 的嗜水气单胞菌特异基因片段，特异性好，最低检测量为10pg 嗜水气单胞菌基因总DNA，可用于鲢鱼嗜水气单胞菌的快速诊断, 对有效治疗和控制鱼类嗜水气单胞菌病的流行具有重要意义。林端等（2007）报道，由国家海洋局南海环境监测中心和国家海洋局第三海洋研究所自主研制开发的鱼类虹彩病毒PCR快速检测试剂盒，特异性高,与其他常见水生生物病毒无交叉反应。该检测试剂盒的最低检测限度为30个病毒粒子,其灵敏度优于国内外其它鱼类虹彩病毒检测方法，适用于多鱼种虹彩病毒病的早期快速诊断、苗种检疫以及水质环境的监测。而史成银（2008）依据大菱鲆红体病虹彩病毒（turbot reddish body iridovirus, TRBIV）主要衣壳蛋白基因序列设计了PCR引物，建立了TRBIV 的PCR 检测方法。
    3、核酸原位杂交技术
    核酸原位杂交技术是在一定生物结构基础之上的核酸杂交，可反应基因杂交的准确部位，即可检测出特定基因的准确位置。常青山等（2000）以海捕中国对虾为材料，利用PCR技术和核酸探针技术，对从中国对虾杆状病毒核酸随机文库中筛选的４个片段，用地高辛标记作为探针，进行斑点杂交，检测对虾杆状病毒。Martha等（2001）以从患TS（Taura Syndrome）病毒的病虾上分离的TSV的cDNA为探针进行原位杂交以检测TSV病毒的存在。
    4、16S rRNA技术
    16S rRNA是核糖体RNA的一种，具有分子量适中、所含的遗传信息丰富等特点。在结构上分为保守区（Conserved domain）和可变区（Variable domain）。保守区能反映生物物种的亲缘关系，可变区能揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是最适细菌系统发育和分类鉴定的指标。目前16S rRNA序列分析已广泛用于水产动物病原菌的鉴定。Ragnhild等（1995）通过对分离于大西洋鲑鱼、虹鳟鱼、大菱鲆和鳕鱼中的致病弧菌的16S rRNA序列进行比对，对鱼类致病弧菌进行分类。Carlos等（1999）通过对26株不同来源的鱼病菌的16S rRNA基因序列的分析，确定了鱼出血性败血病血症病原美人鱼发光杆菌的分类地位，并建立了基于16S rRNA基因的巢式PCR病原检测方法。Cerda等（2001）利用一种特异的16SrRNA基因探针对V.vulnificus 病毒进行检测。邹玉霞等（2004）通过对大菱鲆出血症病原菌的16S rRNA 基因进行系统发育学分析，确定了该病原菌为鳗弧菌。耿毅等（2006）从发生急性流行性传染病的斑点叉尾鱼回肝脏、肾脏分离到一高致病性的菌株，经16S rRNA序列分析，鉴定其为嗜麦芽寡养单胞菌。
五、结语
    近半个世纪以来，随着水产动物疾病研究广泛地与其它先进技术手段相结合，尤其与分子生物学技术的结合，为水产动物疾病快速诊断技术的研发带来了福音。快速准确的病原体检测手段，高效免疫疫苗的制备都在很大程度上缓解了病害所带来的严重损失。然而目前许多快速诊断技术都处实验室研究阶段，将这些快诊技术应用于生产，还有待于条件方法的优化以及仪器设备成本的降低。随着研究的深化，水产动物疾病的快速诊断技术也在不断向前发展，基因芯片（又称DNA芯片）技术的研发也渐有突破。日本水产综合研究中心已经成功开发出利用DNA晶片快速诊断鱼类细菌性疾病的新技术，利用DNA晶片的诊断法与过去只能检出特定病原菌的PCR法或培养法相比，不但在检察时间或步骤上缩短许多，在成本上也比较便宜。利用该技术，以往被归为不明原因的细菌性疾病也能在一次的诊断中检测出来。应用基因芯片技术快速诊断技术确实是一种敏感性强、精确度高的有效检测手段。