氯霉素残留的酶联免疫测定法

A.1  适用范围

本方法适用于测定水产品肌肉组织中氯霉素的残留量。

A.2  原理

利用抗体抗原反应。微孔板包被有针对兔免疫球蛋白（IgG）（氯霉素抗体）的羊抗体，加入氯霉素抗体、氯霉素标记物、标准和样品溶液。游离氯霉素与氯霉素酶标记物竞争氯霉素抗体，同时氯霉素抗体与羊抗体连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被洗去。将酶基质（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并孵育；结合的酶标记物将无色的发色剂转化成蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝变为黄，在450 nm处测量，吸光度与样品的氯霉素浓度成反比。

A.3  检测限

筛选方法的检测下限为1mg/kg。

A.4  仪器

A.4.1  离心机。

A.4.2  微孔酶标仪（450 nm）。

A.4.3  旋转蒸发仪。

A.4.4  混合器。

A.4.5  移液器。

A.4.6  50mL，100mL，450mL微量加液器等。

A.5  药品和试剂

除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。

A.5.1  乙酸乙酯。

A.5.2  乙腈。

A.5.3  正己烷。

A.5.4  磷酸盐缓冲液（PBS）（pH7.2）：0.55 g磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O），2.85 g磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O），9 g氯化钠（NaCl）加入蒸馏水至1 000 mL。

A.6  标准溶液

分别取标准浓缩液50 mL用450 mL缓冲液1（试剂盒提供）稀释并混均匀，制成0、50ng/L、50 ng/L、450 ng/L、1 350 ng/L、4 050 ng/L的标准溶液。

A.7  样品提取和纯化

A.7.1  取5.0 g粉碎的鱼肉样品（样品先去脂肪组织），与20 mL乙腈水溶液（86+16）混合10 min,15℃离心10 min（4 000r/min）。

A.7.2  取3 mL上清液与3 mL蒸馏水混合，加入4.5 mL乙酸乙酯混合10 min，15℃离心10 min（4 000r/min）。

A.7.3  将乙酸乙酯层转移至另一瓶中继续干燥，用1.5 mL缓冲液1溶液干燥的残留物，加入1.5 mL正己烷混合。

A.7.4  完全除去正己烷层（上层），取50mL水箱进行分析。

A.8  样品测定程序

A.8.1  将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，记录下标准和样品的位置，每一样品和标准做两个平行实验。

A.8.2  加入50mL稀释了的酶标记物到微孔底部，再加入50mL的标准或处理好的样品液到各自的微孔中。

A.8.3  加入50mL稀释了的抗体溶液到每一个微孔底部充分混合，在室温孵育2 h。

A.8.4  倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每行拍打3次）以保证完全除去孔中的液体，然后用250mL蒸馏水充入孔中，再次倒掉微孔中的液体，再重复操作两次。

A.8.5  加入50mL基质、50mL发色试剂到微孔中，充分混合并在室温、暗处孵育30 min。

A.8.6  加入100mL反应停止液到微孔中，混合好，以空气为空白，在450 nm处测量吸光度值（注意：必须在加入反应停止液后60 min内读取吸光度值）。

A.9  结果

所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）的吸光度值再乘以100，得到以百分比给出的吸光度值，以式（A.1）表示：

                                                  ·············· （A.1）

式中：

E——吸光度值，%；

A——标准或样品的吸光度值；

A0——0标准的吸光度值。