我国海水养殖贝类弧菌病研究进展

中国水产门户网报道山东省水产养殖病害防治中心：摘要：综述了弧菌的致病机理，对我国主要养殖贝类的危害以及对其检测方法的进展，提出了养殖贝类弧菌病的一系列防治措施，另外对贝类弧菌病的研究方向也进行了探讨和展望。
关键词：养殖贝类；弧菌；弧菌病；致病机理；防治技术
弧菌是海洋环境中最常见的细菌类群之一，广泛分布于近岸、河口海区的海水和生物体中，其致病性受宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素的影响较大，是一类条件致病菌。弧菌是海水养殖动物的主要病原菌之一，早在1970年TUBIASH等fl1就证实弧菌是长牡蛎Crassostrea gigas和欧洲扁牡蛎Ostrea lurida幼体坏死性疾病的病原，随后，BROWN和LOSEE也发现弧菌可以诱导美洲牡蛎Crassostren virgtnica的幼体发病。迄今作为海水养殖动物弧菌病病原菌已被报道过的有2O多种，危害的对象包括鱼类，甲壳类和贝类动物，给我国的海水养殖事业带来了很大的损失。从现有资料可知，我国养殖贝类因微生物疾病导致死亡而造成的经济损失每年达到(20～30)亿元。而弧菌是引起贝类死亡的一类重要的病原微生物，主要危害鲍，扇贝，蛤，牡蛎等。因此，预防与控制养殖贝类弧菌病的发生，加强弧菌病的研究，对贝类养殖业可持续发展具有重要的意义。本文综述了弧菌的致病机理，对我国主要养殖贝类的危害及对弧菌疴陕速检测方法的研究进展，并提出养殖贝类弧菌病的一系列防治措施。

1 弧菌的致病机理

与其他病原菌一样，弧菌的致病性取决于弧菌与宿主细胞间的相互作用，致病过程也包括黏附、侵袭、体内增殖、产生毒素及宿主死亡等系列过程，ELSTON和LEIBOVITZ通过研究美洲牡蛎幼体弧菌病证实了这种致病过程，在长牡蛎、欧洲扁牡蛎、硬壳蛤Mercenaria mercenaria的许多研究也都证实了类似的疾病发展过程。致病过程中病原菌黏附是关键的致病原因，对细菌侵入宿主细胞并有效发挥毒素等的作用具有重要意义，这种黏附取决于细菌表面的特异结构，即黏附素。弧菌具有多种黏附素，菌体的胞外产物如蛋白酶类以及菌体本身的组成成分如外膜蛋白等，均可介导弧菌黏附于宿主细胞。最小弧菌Vibrw mimwus可以产生3种类型的黏附素，其中两种黏附素是菌体细胞的主要成分；霍乱弧菌可通过鞭毛鞘蛋白黏附作用黏附于人回肠黏膜细胞；据UCHIMURA等报道，菌毛在创伤弧菌Vibrw vulnificus、最小弧菌的致病过程中介导菌体远距离的黏附，但其机理还不清楚。
弧菌产生的各种毒素因子在致病过程中起着不容忽视的作用，目前已发现的弧菌毒力因子有外毒素(Exotoxin)、蛋白酶(Protease)、荚膜(Capsule)、载铁体(Siderophore)及外膜蛋白(Outer membrane protein，OMP)等。研究证实荚膜是创伤弧菌的重要毒力因子，创伤弧菌的致病性与荚膜的有无直接相关，创伤弧菌还能产生一种低分子量的载铁体，它对铁具有高度的亲和性，在两种外膜蛋白的参与下能从宿主的转铁蛋白、乳铁蛋白中摄取铁来满足自身的生长繁殖的需要；CROSA研究证明，如果清除控制编码鳗弧菌Vibri0 anguillarum 775的载铁体产生的质粒pjM1，鳗弧菌775就失去致病性。蛋白酶类是致病菌造成宿主机体的组织损伤的重要因素，而外毒素对宿主具有直接攻毒作用，加强了致病菌对宿主的破坏。李太武等研究表明，皱纹盘鲍Haliotis discushanna脓疱病病原菌一河流弧菌Vibrio fluvialis能分泌蛋白酶、脂肪酶等胞外酶，并证明胞外毒素(包括蛋白酶)是河流弧菌引起脓疱病并致死的主要因素。

2 对主要养殖贝类的危害

2．1 鲍
引发鲍病的病原主要有细菌、病毒、寄生虫和立克次氏体等。在各类鲍病害中，以弧菌病为主的细菌性疾病是最常见和最主要的疾病，严重制约着养鲍业的发展。河流弧菌和坎氏弧菌Vibro campbellii是引起鲍细菌性脓胞病的主要病原，李霞等认为河流弧菌可以引起皱纹盘鲍的脓胞病，病理表现为足肌上有多处微微隆起的白色脓疱，几天以后脓疱破裂，流出大量的白色脓汁，并留下2～5mm不等的深孔，使足面肌肉呈现不同程度的溃烂。马建民等在大连沿海的病鲍中分离出鲍脓毒败血症病原菌一坎氏弧菌，该菌通过分泌胞外酶破坏正常组织，使鲍腹足肌出现脓胞，该病在水温l6℃以上出现，水温越高患病越严重，且发现坎氏弧菌的致病性强于溶藻弧菌Vibrio alginolyticus，但也有报道认为导致福建省的九孔鲍Haliotis diversicolor supertexta发生脓疱病的主要致病菌为溶藻弧菌而非河流弧菌，其症状与皱纹盘鲍脓疱病相似，但对药物的敏感性却不同；黄万红研究证实副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus可导致九孔鲍的外套膜破裂，使外套膜与鲍壳连接处变为褐色并易分离，严重时外套膜多在内脏角状体处破裂，内脏裸露，上、下足肌肉变软腐烂致死。也有报道证实副溶血弧菌可以引起九孔鲍幼鲍患萎缩症和鲍苗的脱板症；溶藻弧菌主要引起红鲍幼虫的死亡，同时也是南方九孔鲍急性死亡脱落症的病原菌，而庞启华等报道了从正常九孔鲍的消化腺分离到了溶藻弧菌和恶臭假单胞菌Pseudomonas putida，因此，溶藻弧菌很可能为条件致病菌。王崇明等和陈志胜等也分别报道了创伤弧菌和亮弧菌Vibrio splendidus在一定条件下可以导致鲍发病死亡。

2．2 蛤类
弧菌是导致文蛤Meretrix meretrix发病的主要致病菌，表现为不能潜入沙中，双壳不能紧闭，壳边缘有许多粘液，消化道内细菌大量繁殖，郑国兴等认为溶藻弧菌是引起江苏沿岸文蛤大规模死亡的病原菌，电镜观察到该菌在文蛤肠上皮细胞质中生长繁殖，导致上皮细胞微绒毛的超微结构遭到破坏，而其它组织未见，推测该菌不是经伤口进人体内，而是一种肠道传染病；副溶血弧菌不仅对文蛤有很强的致病性，也是引起食源性疾病的主要病原之一，是我国沿海地区食物中毒和夏季腹泻的重要病原。从江苏南部滩涂死亡的文蛤中分离出另一种菌，经鉴定为弗尼斯弧菌Vibrio furnissii，通过文蛤人工感染试验证明，溶藻弧菌、副溶血弧菌和弗尼斯弧菌均可引起文蛤死亡，但以弗尼斯弧菌感染死亡率最高。对青蛤体内细菌群落的研究发现，弧菌是主要的致病菌，因此，蛤类微生物性疾病可能是由多种弧菌共同感染所致。

2．3 扇贝
弧菌是引起扇贝发病的主要细菌性病原体，主要表现为扇贝面盘上细胞脱落，鞭毛分解，或细胞解体。栉孔扇贝Chlamys farreri因细菌性疾病呈现两个死亡高峰期，其一为春季高峰期(3～5月)，死亡率达50％；其二为夏季高峰期(6～9月)，尤以8月为重，死亡率高达80％以上；海湾扇贝Argopecten irradians死亡高峰时间一般在7～l0月，死亡率在50％以上，而这两个高峰期也是弧菌病的高发期。RIQUELME等报道，鳗弧菌等弧菌和假单胞杆菌Pseudernonas sp．等皆为智利扇贝Argopecten purpuratus幼体的潜在致病菌，可严重抑制智利扇贝幼体浮游并引起大量死亡，并对于病原菌的传播途径、流行病的防治等也做了多方面的探讨。已被证实的海湾扇贝致病菌还有漂浮弧菌Vibrio natritgen、黑美人弧菌Vibrio nigripulchritudo以及哈氏弧菌Vibrio Harveyi，漂浮弧菌可导致扇贝肠道及肾肿胀、生殖腺及外套膜萎缩、壳内面变黑。黑美人弧菌不仅可导致海湾扇贝外套膜收缩，脱落，鳃糜烂，肠管空并伴有不同程度的肾肿胀，同时也是又是海湾扇贝幼体面盘解体流行病病原菌。通过不同温度下注射不同密度细菌的感染试验证明，哈氏弧菌对扇贝的致病陛与感染强度及温度有密切关系。

2．4 牡蛎
幼体牡蛎溃疡病的病原主要为弧菌，如鳗弧菌、溶藻弧菌，也有发现气单胞菌属Aeremenas sp．和假单胞菌属。邓欢等认为弧菌是引起1991大连太平洋牡蛎流行病的主要病原；利用MPN法及APIE系统检测厦门浔江湾牡蛎养殖区弧菌，发现其春夏季密度大于秋冬季，牡蛎体内弧菌密度与水环境、沉积环境弧菌含量呈显著相关性，因此牡蛎弧菌感染与环境有密切关系。沈晓盛等研究证实坎氏弧菌有溶血现象，能产生某种细胞外毒素，从而引起养殖牡蛎发病。GOOCH和BORAGJUNI等研究报道了副溶血弧菌及亮弧菌ⅡVibrio splendidus biovarⅡ也是牡蛎的病原菌，Vibrio splendidus biovarⅡ可致牡蛎幼体患病，该菌成分及体外产物均显毒性，但毒素产力与病原性间无明显相关。

3 检测的方法

病原性海洋弧菌常规的检测方法大多是分离培养、镜检观察、生化鉴定、嗜盐性试验等过程。这些实验操作繁琐，需耗时5～6d，检出率低，从20世纪7O年代起国外开始试行成套的标准化鉴定系统和与之相结合的计算机辅助鉴定系统，使细菌鉴定日益朝着简便化、标准化和自动化的方向发展，GRISEZ等等利用API20E成功地将鳗弧菌与奥氏弧菌分开。
现代血清学、免疫学方法以及分子生物学方法的出现与发展为快速、准确、灵敏地检测病原菌提供了十分有效的方法，可以准确地将病原鉴定到种、甚至亚种的水平。目前已有荧光抗体技术、免疫酶技术、PCR技术用于贝类病原性弧菌的检测。叶林铮用酶联免疫吸附检测技术(ELISA)来检测皱纹盘鲍幼鲍溃烂病的病原菌，王崇明等用双抗夹心ELISA法检测皱纹盘鲍创伤弧菌，其检测的敏感性阈值为1×10５个／mL。NOVEL等利用该法鉴定导致菲律宾蛤仔患棕环病的弧菌P1。张晓华等建立了检测副溶血弧菌的间接ELISA技术，其检测的敏感性阈值为1×10５个／mL (1×10４个／孔)。结果可多次重复，底物显色清晰，不需特殊仪器用肉眼即可观察，快速，并同时可测大量的样品。因此，ELISA技术是病原性海洋弧菌的快速诊断的实用技术。
PCR技术也是广泛应用于海洋贝类病原性弧菌检测的新技术，张新中等采用多重PCR技术可同时检测创伤弧菌1个基因的3个位点，能更为准确地鉴别出病原菌。同时该方法又可以检测副溶血弧菌的gyrB基因，因此能够更为高效的检测病原体。何闪闪等通过PCR技术扩增创伤弧菌的溶细胞毒素(hemolvsin／cvtolysin)基因来检测蛤蜊样品中的创伤弧菌，通过与VVAP探针结合显著地提高了创伤弧菌的检验与分离速度；王华丽等利用PCR方法检测副溶血弧菌基因组DNA的灵敏度为13.2fg/μL。许如苏等报道实施荧光PCR方法可在8h内对水产品中的副溶血性弧菌进行定性或定量检测，其纯菌检测低限低于10 CFU／PCR反应体系。
16S rRNA技术是基于PCR基础上的一种技术，是海洋细菌分类和鉴定的一个有力工具。海洋弧菌16S rRNA基因具有高度保守性，不同的科、种、属间的海洋弧菌基因的同源性达97％以上。因此可以设计针对某一类病原菌特异性的共同引物，以被检测的样品为模板，进行PCR扩增，检测是否有病原菌的存在。目前16S rRNA技术在病原性海洋弧菌的检测方面开始运用，国内采用此技术也已经应用于海水鱼类病原菌的检测之中，但在贝类病原菌的检测中运用的还比较少，沈晓盛等利用16S rRNA技术在牡蛎体内检测出坎氏弧菌，刘广锋等利用16S rDNA技术鉴定出杂色鲍幼苗“急性死亡脱落症”病原菌为溶珊瑚弧菌和溶藻弧菌。邓先余等以16S和16S-23S rDNA间区为靶区建立副溶血弧菌PCR快速检测技术，能有效检测出在九孔鲍、凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei和各种水质中的副溶血弧菌，检测灵敏度为5.6×102 CFU/mL。

4 贝类弧菌病害防治

海洋贝类养殖的可持续发展是我国海水养殖的根本，要达到可持续发展，病害防治的研究是重要内容之一。弧菌是引起贝类发病和死亡的一类重要的病原微生物，弧菌病害综合防治应从以下几方面去实现。

4．1 药物防治
目前，养殖基层对海水贝类弧菌病的防治主要是依赖抗生素治疗，如四环素对文蛤副溶血弧菌感染的治疗作用；沈亚林等发现副溶血弧菌对氯霉素、四环素、强力霉素、复方TMP、呋喃唑酮、卡那霉素、庆大霉素、红霉素、新霉素高度敏感；张晓华研究证实新霉素、氯霉素、磺胺类、美洛西林和多粘菌素B等对漂浮弧菌的抑菌力最强。邓欢发现土霉素、吡哌酸、氯霉素和红霉素对太平洋牡蛎弧菌病均有效。陈全震研究了利用氯霉素、土霉素和盐酸环丙沙星治疗幼鲍病害的有效剂量。对于鲍的河流弧菌感染，交替使用不同药物或不同药物联合使用，即氯霉素、复方新诺明、氟哌酸三种药物中任何两种联合使用时，所需杀菌最低浓度均低于单独使用。宋吉德通过研究几种药物对皱纹盘鲍的毒性，总结出氯霉素、氟哌酸等药物的安全浓度。复方新诺明为鲍养殖生产中破腹病的主要防治药物，治疗有效率可达80％以上。青霉素、复方新诺明、头孢唑啉、庆大霉索、氯霉素、多粘霉素可以作为防治由副溶血弧菌所引起的九孔鲍的掉板症。林永添认为万古霉素、克林霉素、氨苄青霉素等9种药物对紫贻贝Mytilus edulis LinnaeU的病原菌—溶藻弧菌均有明显的抑制作用，但在敏感药物中，目前大部分属禁用药物，因此需要采用其它新的方法对其深入的防治。

4．2 免疫学和生态学防治
利用免疫学和生态学防治方法来控制贝类弧菌病，是近几年对海洋弧菌防治的一种新的方法，也是未来的发展主流，免疫学方法主要是通过激发机体自身的免疫防御系统来提高机体对病害的抵抗能力，从而使其机体免受外来病原生物的侵扰，周永灿等在大珠母贝和合浦珠母贝人工养殖中，通过添加免疫增强剂一氨基多糖，发现大珠母贝成活率提高了30％。合浦珠母贝成活率提高了20％，生长速度也有不同程度的增加；生态防治方法的原理是根据同一生态系统中细菌和其他微生物分泌的抗生素，细菌素或通过营养竞争来杀死或抑制致病性弧菌的大量繁殖，从而达到防治弧菌病的目的。李太武等依据过量噬菌体可以全部裂解其宿主菌河弧菌-Ⅱ的特性，用噬菌体对皱纹盘鲍脓疱病进行了生物防治研究，结果表明，使用一定浓度的噬菌体可以有效地治疗或推迟脓疱病引起的鲍死亡，将鲍的成活率提高50％以上。莫照兰等对弧菌的拮抗菌进行了筛选，发现气味黄杆菌Flavobacterium odoratum分泌的胞外物质具有广泛的弧菌抗菌谱，对哈氏弧菌(分离自中国对虾)、漂浮弧菌(分离自海湾扇贝)和鳗弧菌(分离自鲈鱼)均表现出较强的拮抗作用。莆田市首次在鲍鱼养殖上引进噬菌蛭弧菌，捕食海水里的弧菌等致病菌，在控制弧菌疾病方面取得了显著的效果。

4．3 良种培育提高抗病力
大多数养殖贝类如栉孔扇贝、牡蛎、蛤等，大部分直接来自选育的野生种，经几代养殖后，都出现种质退化问题。因此，培育高质量的贝类种苗，可以提高养殖贝类的抗病能力。国内的专家和学者尝试牡蛎、珠母贝的杂交育种实验均取得了一定的成果，特别皱纹盘鲍与日本盘鲍的杂交后代的优越性，使鲍鱼养殖业近几年出现飞跃性发展。在扇贝方面，国内进行了栉孔扇贝不同地理种群间和物种间的杂交，既提高了其抗病能力，又提高了其商品价值和产量。于瑞海等以栉孔扇贝与虾夷扇贝Patinopecten yessoensis为试验材料。进行二者之间杂交育苗生，培育出适应能力强、生产性状好的优良新品种。此外，利用免疫接种可以提高养殖贝类的抗病能力，例如对三角帆蚌Hyriopsis cumingii接种甲醛灭活病毒可以防治蚌瘟病。

4．4 改善养殖环境，优化养殖模式
养殖环境的改善可以抑制甚至消除病原的繁衍与传播，是控制弧菌病害暴发流行的关键，弧菌属条件致病菌，一旦条件合适便大量繁殖，引起疾病的流行，产生爆发性大面积死亡。弧菌的繁殖与温度密切相关，在15～3O℃内，水温每升高5℃菌体繁殖速度就会增加近一倍。从几年养殖贝类的突发性时间来看，几乎都发生在每年的8～9月，而8～9月除因水温偏高有利于细菌繁生外，同时养殖环境自身污染的不断加重也为条件致病菌的迅速繁衍提供了丰富的营养。贝类暂养场选址应在低潮区，因为水流交换好的环境可以抑制弧菌生长。另外，水环境污染引起养殖贝类机体功能失调也是弧菌感染的诱发因子，因此必须消除环境污染的不良影响。
随着海洋贝类养殖面积、种类的增加，病害亦明显增多加重。解决这一矛盾的根本可能在于养殖模式和防病模式的改变。从单一贝类品种养殖向兼顾环境、养殖容量的立体生态混养模式转变，可以有效地减少疾病的发生。例如，根据养殖水域允许容纳的生物量(依据基础生产力和水体交换能力)来安排贝类与藻类的轮养和套养，或者将海湾扇贝与海带轮养、与对虾混养，均能取得良好的防病效果和生态效益。而由传统的病原体感染传播—疾病流行一预防 防治 死亡的病害控制体系向预防为主综合防治的体系转变，可以大大减少发病的几率。

5 结束语

随着我国贝类养殖规模的扩大，贝病发病亦趋上升，给人们带来了严重的损失，相对而言，贝病研究则刚起步，无论在广度和深度都远不能适应目前贝类养殖生产的要求，因此，加强贝类病害学基础和实际应用研究以适应我国贝类养殖的发展形势就成为目前一项迫切的任务。加强贝类病原性弧菌基础理论研究，重点放在其病因学和流行病学上，针对贝类养殖与防病的关系，研究探索最佳的养殖模式，同时要积极研究开发养殖贝类弧菌病的防治药物。抗生素虽有使用方便、见效快和疗效好等优点，但在实际生产中存在的盲目使用和滥用药物现象，不仅破坏了养殖环境微生态，导致耐药性生物的产生，而且存在的药物残留也会危及人类健康；通过免疫学技术激发机体自身的免疫防御系统，提高对各种病害的抵抗能力，通过更换养殖贝种、进行生态调控、选择育种等提高养殖贝类自身抗病能力，才能从根本上预防各种海洋养殖贝类重大流行性疾病的暴发与流行。