鱼类抗病毒非特异性免疫机制研究进展

摘要：鱼类抗病毒非特异性免疫系统主要包括自然杀伤细胞、单核巨噬细胞系统及干扰素，蛋白因子白介素、趋化因子、肿瘤坏死因子及干扰素诱导产生的蛋白激酶PKR、Mx蛋白、主要组织相容性蛋白、一氧化氮合成酶在鱼类抗病毒免疫中发挥重要的作用。了解病毒与鱼体之间的相互作用机理，为鱼类病毒性疾病防控奠定基础。

关键词：鱼类；抗病毒；非特异性免疫

 

鱼类病毒病是严重影响水产养殖业的世界性难题。经典的免疫学理论将机体的抗病毒免疫分为两部分，即特异性免疫及非特异性免疫。在进化过程中，鱼类处于连接高等脊椎动物和低等无脊椎动物的特殊地位。其特异性免疫机制不完善，非特异性免疫占重要地位，免疫易受水温的影响。

遇到病原后，首先并迅速起防卫作用的是非特异性免疫应答。在鱼类体内执行非特异性免疫应答的有吞噬细胞、自然杀伤细胞及血液和体液中存在的抗菌分子，它们在鱼类防止感染中扮演重要角色。对于病毒而言，具有重要意义的非特异性免疫细胞有两类，一类是自然杀伤细胞(NK)，另一类是单核巨噬细胞系统。与此同时，某些非特异性的体液因子也发挥了重要作用，其中最具代表意义的是干扰素(IFN)。

 

 

    自然杀伤细胞(NK细胞)是一类由骨髓干细胞分化而来的非特异杀伤细胞。表型特点是表达其表面特有的抗原标记CD56和CD16。从细胞特性来说，NK细胞既参与非特异性免疫应答，也通过与特异性T淋巴细胞在杀伤功能上的互补作用参与特异性免疫应答。在病毒感染中，NK 细胞通过多糖及脂多糖分子直接杀伤被病毒感染的组织细胞；同时，还能够以另一种与其他受体交联识别的方式杀伤病毒感染的细胞。大多数病毒感染细胞后主动下调宿主细胞表面MHCⅠ类分子的表达，从而避开MHCⅠ类分子限制的细胞毒性杀伤作用(CTL)对感染细胞的杀伤，而NK细胞所表达的杀伤抑制受体(killer inhibitory receptor，KIR)与CD16及多糖蛋白受体的交联，可识别那些由于病毒感染而下调了MHCⅠ类分子表达的细胞。另外，NK细胞表面具有白介素2(IL-2)和白介素12(IL-12)受体，在病毒侵入机体形成最初炎症时，可以被炎性因子及趋化因子诱导产生的IL-2直接激活而成为抗病毒感染的前锋。同时，NK 细胞在激活后还可分泌γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。

 

    白介素(Interleukin，IL)是与鱼类致炎作用以及调理功能密切相关的一个功能性蛋白家族。白介素家族的典型成员包括了IL-1，IL-2，IL-6等，其中IL-1包括IL-1α，IL-1β1和IL-1β2都属于三叶草型细胞因子家族的成员。在鱼的体内，白介素样分子参与并且在免疫反应中发挥重要作用。已经报道在鲤鱼(Cyprinus carpio)、斑点叉尾鲴(Ictalurus punctatus)和大西洋鲑(Salmo salar)体内存在IL-1样分子。Pelegry P等用RT-PCR方法分离克隆了乌颊海鲷(Aparus macrocephalus)的IL-1β基因。Engelsma M Y等检测了鲤鱼脑、垂体、头肾、脾脏中的IL-1βmRNA 的表达。Kono T等用DNA注射方法研究鲤鱼对于IL-1β的免疫反应。Bird S 等用RT-PCR 方法在小点猫鲨(Scyliorhinus canicula)的脾脏和睾丸中发现有IL-1β基因的表达，并且证明其和虹鳟IL-1β有31.7%的相同氨基酸组成。董伟仁等利用比较基因组学方法，在河豚(Fugu rubripes)基因组中鉴定了IL-2基因。邱丽华等采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)的方法，从经LPS刺激的花鲈(Lateolabrax japonicus)总RNA反转录产物中获得了803 bp的IL-8 cDNA序列。

 

趋化因子包括了约4O种小分子分泌型细胞因子，根据氨基酸序列中头两个半胱氨酸残基的总数目进行分类，可分为CXC、CC、C和CX3C等几种。在鱼类中，已见报道的有CXC和CC家族的成员，趋化因子受体基因也有报道发现。首先报道的鱼类趋化因子属于CXC型，它是由一种元颌鱼七鳃鳗(Lam petra fluviatilis)编码的类L8多肽，Liu L等克隆了虹鳟(Oncorhynchus mykiss)体内的趋化因子家族的CC基因。Kuroda N等鉴定了硬骨鱼类趋化因子家族的7个新成员。与在哺乳动物体内一样，鱼类体内的趋化因子在中性粒细胞和巨噬细胞的迁移过程中可以作为潜在化学引诱物存在。其激活一般要和有7个跨膜区域的G蛋白偶联受体结合共调节。

 

肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是鱼类体内存在的肿瘤坏死因子的主要成员。TNF-α是β-Jellyroll家族的成员，在细胞膜内以Ⅱ型跨膜蛋白或糖蛋白的形式存在，蛋白质C端区域通过剪切释放具有生物学活性的功能肽。近年来，采用同源克隆和EST等分子生物学手段，已从虹鳟、金头鲷(Sparus aurata)、斑马鱼(Danio rerio)、鲤鱼、真鲷(Pagrus major)等多个养殖品种中克隆到TNF-α基因。鱼体在脂多糖(LPS)和刀豆蛋白A(ConA)等刺激剂刺激下产生的细胞因子可以和哺乳动物TNF-α进行交叉反应，并且具有激活巨噬细胞的生物学功能。Hirono I等研究认为，牙鲆(Paralychthys olivaceus)TNF-α的cDNA序列为TNF-α家族的典型序列。虹鳟体内有140 bp的5’UTR，506 bp的3’UTR，739 bp的

开放阅读框(ORF)，试验证明，在牙鲆的外周血白细胞和肾脏中都有TNF-α的表达。

 

 

单核巨噬系统在各组织部位的细胞，作为一类重要的集吞噬与抗原递呈作用为一体的细胞，在联系非特异性抗病毒反应与特异性抗病毒免疫反应中更具有重要意义。它们可以吞噬被病毒感染的细胞及被病毒破坏的细胞碎片，经酶水解等过程，将病毒抗原分子降解成为小分子肽段，并通过其自身表达的MHC Ⅱ类分子递呈于细胞表面，从而激活特异性T淋巴细胞和B淋巴细胞反应，将抗病毒免疫由非特异性反应引入特异性反应。它同时可以利用其吞噬功能，通过表面的多糖受体和Fc受体，非特异的清除组织中的病毒颗粒及病毒感染细胞。Neurnannl N F等在鲫(Carassius auratus)头肾细胞培养物中分离出形态、细胞化学和杀菌机制不同的三类巨噬细胞。鱼类的巨噬细胞不仅具有杀伤细菌及寄生虫的作用，而且能够在受到微生物侵扰时被微生物的有害产物激活。另外，与哺乳动物类似，鱼类巨噬细胞执行免疫功能和细胞因子多层次多方面进行相互协同的调节。

 

 

IFN系统是脊椎动物抵抗病毒入侵的第一道屏障，能在病毒感染后几小时内迅速起作用，而特异性抗体要在几天或几周之后才能由淋巴细胞产生。根据来源、序列、活性等方面的区别，干扰素最初分为两族，Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干素。Ⅰ型干扰素主要包括人体内发现的α、β、ω、κ，以及在反刍动物中发现的τ和在小鼠中发现的ζ等几个亚族。Ⅱ型干扰素只有一种γ干扰素。近年发现的λ干扰素(IFN-λ)被认为是新的一族干扰素。

Gravell等首次发现传染性胰腺坏死病毒(IPNV)在23℃ 能诱导黑头软头鲦的鳍传代细胞FHM分泌一种类似哺乳类IFN的抗病毒活性物质。此后又在多种病毒感染的鱼类和鱼类培养细胞中得到证实，如虹鳟、舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)、大麻哈鱼(0．keta)、鲤鱼、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、金鱼(Carassius aurattus Li．)、鲫鱼、牙鲆等，并发现鱼类IFN至少有两类：第一类为耐酸(pH 2稳定)、耐热。由病毒或dsRNA等诱导，性质与哺乳类I型IFN相似。如病毒性溶血败血症病毒(VHSV)和PolyI：C诱导的鲑类IFN都有酸稳定性；第二类为不耐酸、不耐热。由白细胞、T细胞或巨噬细胞产生，由丝分裂素等诱导，与哺乳类Ⅱ型IFN相似。早在1967年，Sigel就指出，鱼类IFN可能是鱼类特异性免疫反应不足的一种补充，水温较低鱼体免疫低下时，它的合成在抵抗病毒感染中能发挥重要作用。

 

由干扰素诱导的，形成细胞及机体抗病毒状态的反应产物，均是细胞内具有一定功能的蛋白分子，它们各自在细胞特定生物学状态下执行相应的生理功能，但当它们在病毒即将感染的细胞内形成一个系统时，各自的生物学功能通过整合相加，从而形成一个具有较大威力的抗病毒状态。这些蛋白分子中，蛋白激酶PKR、Mx蛋白、主要组织相容性抗原、一氧化氮合成酶(NOS)在鱼类中已有研究。

3．1．1 蛋白激酶  蛋白激酶(PKR)是一类可由干扰素诱导产生、RNA依赖的丝氨酸蛋白激酶。在干扰素处理的细胞中，PKR主要出现于细胞质内，并与核糖体相连，细胞核内也可见到小量的PKR存在。PKR作为抗病毒因子的基本机理，是其对病毒mRNA翻译环节的抑制。通常直接激活PKR的是双链形式的RNA，它使PKR 自动发生磷酸化。活化后的PKR至少可使6个蛋白质分子内的磷酸化过程被催化。胡成钰等根据鲫鱼类PKR蛋白激酶基因(CaPKR-like)的全长cDNA序列，克隆CaPKR-like Zα结构域cDNA，表明CaPKR-like蛋白在病毒感染的细胞中很可能也能结合dsRNA，并形成二聚体，行使类似哺乳类PKR的各种生理功能。

3．1．2 GTPase的活性的Mx蛋白  干扰素诱导产生的细胞蛋白中，对包括MxA和Mx1的Mx蛋白家族认识比较充分。动物试验和细胞水平上的分析，都已充分肯定了Mx蛋白对病毒增殖过程的有效阻滞，它的特点是不需要其他干扰素诱导成分的辅助，自身就可以表现抗病毒活性。这个蛋白事实上是属于类动力蛋白GTPase的超家族成员，而且此酶的活性本身就是抗病毒活性所需。

利用Poly I：C及病毒在虹鳟、大西洋鲑、牙鲆以及鱼类细胞系RTG22、CHSE2214等都能成功诱导Mx蛋白或Mx、mRNA的表达。虹鳟的3个Mx基因、大西洋鲑3个Mx基因以及牙鲆Mx和cDNA都已经成功克隆。所有鱼类Mx都具有脊椎Mx蛋白的结构特征，包含一个三联体GTP结合区域，在MX蛋白的C端有高度保守的Leu拉链。向虹鳟肌肉注射包含编码病毒VHSV糖蛋白基因的质粒进行DNA免疫，除了能产生很强的激素应答反应外，还能激活机体特异性或非特异性的抗病毒机制，其中Mx和mRNA强烈表达。天然野天村病毒感染鲶鱼可以显著的上调Mx和mRNA在所有组织中的表达。进一步研究表明，DNA免疫虹蹲，在早期可能是诱导鱼体非特异性的抗病毒机制，由Ⅰ型IFN介导初步保护；较长期的保护则是诱导产生对免疫基因(如病毒糖蛋白基因)特异性的抗病毒反应。同样，所有经编码病毒糖蛋白基因免疫的虹鳟均能从肾和肝检测到高浓度的Mx蛋白，表明Mx蛋白的表达与鱼体的抗病毒机制有一定的相关性。

3．1．3 主要组织相容性抗原  主要组织相容性抗原是非特异性免疫系统中极其复杂和最具多态性的一类分子。可分为结构上和功能上都不同的Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类(Ⅲ类为补体系统的成分)。其中Ⅰ类和Ⅱ类抗原分子均是表达在细胞表面的穿膜型糖蛋白，各由两条不同的多肽链借非共价键组成异二聚体结构，其共性是具有抗原多肽结合区。鱼类主要组织相容性抗原包括MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子。近年来已从鲤、大西洋鲑、斑马鱼、虹鳟等多种鱼类中克隆MHCⅠ类分子和Ⅱ类分子基因，二者具有独立的免疫学应答。鱼类MHC分子的成功分离和纯化，证明与其他物种(如哺乳动物)MHC分子具有高度的同源性，并显示其与免疫球蛋白(Ig)超家族可变族高度相似。

3．1．4 诱导型一氧化氮合成酶  干扰素诱导的一氧化氮合成酶(NOS)是一类催化依赖于NADPH氧化L-精氨酸产生一氧化氮和胍氨酸的酶，它包括同属一个家族的3个同工酶，即NOS，神经细胞NOS和内皮细胞NOS。NOS可以增加一氧化氮的产生，后者可以激活巨噬细胞的功能，使其在天然免疫和获得性免疫反应中发挥作用。Saeij J P等用鲦鱼的NOS寡核苷酸序列作为引物，扩增出了鲫的NOS cDNA文库，序列数据中有57%和人的NOS相同。用鲑鱼菌(Renibacterium salmoninarumv)经注射或浸泡方法处理虹鳟后，在其鳃和头肾中均发现有NOS的表达，在鱼类中已经确认巨噬细胞释放的细胞因子可以调节NOS的活性，还证明在鱼类体内存在的NOS激活机制和哺乳动物的类似。

    近40年来的研究认为，鱼类存在IFN系统的证据，主要来自对病毒诱导的培养细胞上清液进行检测时，发现的具有类似哺乳类IFN的抗病毒活性物质，但是，直到今天，也没有成功纯化出任何一种鱼类IFN蛋白。

 

IFN诱导的抗病毒机制主要有3条途径，即PKR(依赖dsRNA 的蛋白激酶途径)、2-5A合成酶途径和Mx蛋白质途径。PKR是一类由病毒双链RNA激活的激酶，能磷酸化真核起始因子2(eIF2)，最后导致对病毒和细胞蛋白合成的抑制。2-5A合成酶被病毒双链RNA激活后，将ATP转化为2’，5’-环状寡聚腺苷酸，后者激活核酸酶L(RNase L)，降解病毒和细胞mRNA。Mx蛋白属于动力蛋白家族的GTP酶，据推测其通过抑制病毒核衣壳在细胞内的转移而抑制病毒的复制。

最近鱼类IFN系统基因的鉴定和克隆取得了重大进展，不仅有IFN基因，而且还包括参与IFN信号通路、表达调控及IFN诱导的具有抗病毒功能的ISG。在IFN诱导细胞抗病毒状态之前加入微量ActD，可使IFN的抗病毒作用消失，表明鱼类IFN对病毒的抑制作用是通过对细胞内转录和转译水平的调控来完成的，依赖于细胞内RNA和蛋白质的合成。在同种细胞上，鱼类IFN具有广谱抗病毒活性，对鱼类和非鱼类病毒、RNA 和DNA 病毒都有抑制作用。

 

 

在病毒感染早期，除病毒抗原诱发的少量抗体的中和作用外，非特异性免疫系统发挥重要作用，随着病毒感染程度的深入，细胞免疫不断强化才能清除病毒。病毒致病可能通过dsRNA和PKR的激活抑制宿主蛋白表达，也与复制过程中mRNA引物的使用导致宿主mRNA降解有关。在病毒与宿主细胞相互作用制约的感染过程中，病毒能够利用其特殊的病毒编码产物干扰和颉颃宿主免疫反应，使病毒能长期生存。在控制病毒性疾病过程中病毒疫苗发挥重要作用，尽管在病毒疫苗研制领域中，还有各种技术问题需要进一步的探索，但是近年所面临的是对病毒与宿主细胞及机体之间的关系知之甚少。因此，加强对病毒与细胞、机体的相互关系的研究，是提升防治病毒性疾病整体技术能力的基础。

                                           王亚楠^1，2，孔晓瑜¹，史成银²