生物技术在水产养殖中的应用

中国水产门户网报道生物技术研究是指人们运用现代生物学、工程学和其它基础学科的知识，按照预先的设计对生物进行控制和改造或模拟生物及其功能，用来发展商业性加工、产品生产和社会服务的新兴技术领域。近十几年来，生物技术迅猛发展，呈方兴未艾之势。目前，许多生物技术成果已在渔业上得到应用。例如，我国转牛、羊基因鱼技术已达到国际先进水平；罗非鱼和虹鳟鱼遗传链锁图谱的制备及其部分数量性状基因位点（性别、生长、体色）的定位研究，为这些性状的DNA分子标记辅助育种奠定了良好基础；日本、美国、加拿大等国还相继克隆出大麻哈、虹鳟、罗非鱼、真鲷等的生长激素基因、催乳素基因及抗冻蛋白基因，并成功地在微生物中表达生产了一些鱼类的生长激素和其它重要蛋白。到目前为止，国外已先后在草鱼、鲤、虹鳟、罗非鱼、牙鲆、扇贝、牡蛎、对虾、鲍鱼等20多种鱼、虾、贝类上得到多倍体染色体育种工程技术的成功，这些多倍体新品种的生长速度明显快于其亲本；法国、日本、挪威等国获得的虹鳟、硬头鳟、大西洋鲑、红鲑等鱼的雌核发育系为人工诱导雌核发育技术育种展示了广阔前景；我国对虾白斑病基因的破译，为其病害防治技术提供了可靠的药物筛选依据；水产病害检测技术的发展也为控制疾病的发生提供了必要的措施；通过免疫手段来防治水生动物疾病已成为当前研究的热点；另外，利用生物技术保护水生环境、治理污染也是水体生态环境保护及其产业可持续发展的重要生物工程手段。

　　1 基因操作技术

　　1．l 基因克隆

　　这是一种以蛋白质特殊功能为前提的克隆方法，也是基因克隆中较早采用的策略之一。首先，构建基因或cDNA表达文库，然后将表达文库分成若干亚文库分别转染细胞，通过一些特定的灵敏的生理生化指标或抗体免疫反应来检测亚文库表达产物的功能，在检测得到阳性亚文库后，一种途径是进一步对亚文库再分小，重复筛选，直至最后得到单克隆功能基因；另一种途径则是利用原位免疫组化的方法分离出呈阳性反应的单细胞，进而分离出相应的功能基因。此外，还有许多新的基因克隆技术如基因组错配筛选（GMS）、代表性差异分析（RDA）、外显子扩增技术以及mRNA差异显示技术也具有广泛的应用潜力。对有代表性的水生生物（包括鱼、虾、贝及病原体微生物和病毒）基因组进行全序列测定，同时进行特定功能基因，如药物基因、酶基因、激素多肽基因、抗病基因和耐盐基因等的克隆和功能分析是克隆技术所研究的重点。目前已经鉴定和克隆出的基因包括：南美白对虾抗菌肽基因，牡蛎变应原（allergen）基因、大西洋鳗和大西洋鲑抗体基因、虹鳟Vasa基因、青鱼将P53基因组基因、双鞭毛藻类真核启始因子5A基因。条纹鲈GTH（促性腺激素）受体cDNA、鲍肌动蛋白基因、蓝细菌丙酮酸激酶基因、鲤鱼视紫红质基因调节系列以及牙鲆溶菌酶基因等。

　　1.2 基因转移

　　基因转移作为生物遗传改良、培育快速生长和抗逆优良品种的有效技术手段，已成为应用技术研究发展的重点。大批量、高效转基因方法是基因转移研究的重点，除传统的显微注射法、基因枪法和精子携带法外，目前已发展了逆转录病毒介导法、电穿孔法、转座子介导法及胚胎细胞介导法等。近几年研究集中在目标基因筛选，如抗病基因、胰岛素生长因子基因及绿色荧光蛋白基因等作为目标基因。Hayat（1991）等成功地把人的以及鲑鳟鱼的生长激素显微注射到鲶鱼和鲤鱼卵中；Rahman（1992）等把大鼠金属硫结合蛋白基因和小鼠生长激素注射到单细胞阶段的罗非鱼卵中，获得了大约 20％的整合率；Gross（1992）把牛生长激素基因转移到狗鱼中等。以上研究多数采用外源基因，从安全性、外源基因的表达强度和世代传递等方面考虑，采用鱼类自身的“全鱼基因”可能较为理想。Du（1992）等最先使用“全鱼基因”向大西洋鲑受精卵转移生长激素基因，获得的转基因鱼个体重量比对照组平均大38倍。转基因鱼的子一代个体的平均重量比对照组大5．2倍。在转基因研究的种类上，目前已从经济养殖鱼类逐步扩展到养殖虾、贝类及某些观赏鱼类。

　　1．3 基因芯片

　　基因芯片技术又称基因微阵列技术，是指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400）核酸探针分子固定于载体（玻片或薄膜）后与标记的样品分子（mRNA，cDNA，基因组DNA等）进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。该技术的最大优点是可以一次性对大量样品序列进行检测和分析。目前，通过设计不同的探针阵列组合和使用特定的分析方法，基因芯片技术已经广泛应用于基因表达诺测定。突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等许多方面。基因芯片技术应用的先决条件是要有大量的已知序列的探针分子，而目前已测定的水生生物基因数目非常有限，这大大局限了基因芯片技术在水生生物功能基因组研究中的应用。

　　l．4 遗传标记

　　限制性内切酶（RFLP）技术、随机扩增多态性（RAPD）技术、DNA指纹分析技术、扩增片段长度多态性（AFPL）等分子标记技术用于基因多样性分析，为种质鉴定和遗传育种提供依据。Knox（1991）等应用质粒DNA限制片段长度的多态性分别分辨洄游和陆封大西洋鲑的种群和挪威养殖的以及苏格兰野生的大西洋鲑的种群差异。Moran（1996）等应用质粒DNA的变异分辨西班牙河流中的人工孵化和野生欧鳟种群并发现种群大小与质粒DNA变异的关系。Carter（1991）等和Gross（1994）等用DNA指纹谱技术分别对雌核生殖罗非鱼进行鉴别和小口黑鲈的不同群体的鉴别。孙效文等（2000）将RAPD技术与SSLP（简单序列长度多态性）技术结合起来，初步建立了鲤鱼遗传连锁图谱。王志勇等（ 2002）利用 AFLP技术研究了中国沿海真鲷群体的遗传变异和趋异。

　　2 细胞和染色体组技术

　　2．l 多倍体诱导

　　通常动植物细胞染色体组为2组。由自然环境因素或人工特殊处理形成2组以上染色体的动物体称为多倍体。一般人工诱导的主要目的在于利用三倍体，三倍体具有生长快、净肉率高、肉质好，生命周期长等特点；另外三倍体还有利于种群控制，具有较高的抗病力和抗逆性。Valenti(1975）等对澳大利亚罗非鱼的受精卵进行冷处理，诱导出75％的多倍体且孵化率高达90％。洪云汉（1990）对鳙鱼卵在第一次卵裂前进行热处理，获得了56．3％的四倍体。Myers（1991）比较了分别由正常受精卵经热处理和从四倍体与二倍体杂交获得的两类三倍体硬头鳟，发现前者前期生长较差，后者的存活率高但受精率较低。Guo（1996）等采用二倍体和四倍体太平洋牡蛎生产出100％的三倍体牡蛎，其个体比正常二倍体大13％～51％。与在河口养殖近4个月的结果表明三倍体的闭壳肌比对照组重73％，平均体组织湿重高36％。大多数三倍体贝类在夏季期间性腺不成熟，在生长期闭壳股长的重量和糖元指标明显高于对照组。

　　2．2 雌核发育

　　雌核发育指的是卵子需要精子的激活但精子并不提供遗传物质的一种单性生殖方式。自然界存在这种单性生殖的水生动物，人工诱发手段也可使未受精卵进行雌核生殖，但产生的个体绝大多数是单倍体，难以存活，需紧接着二倍化的特殊处理。诱发雌核发育除了可以加快建立选育系和控制性别外，还可以使一些稀有的隐性等位基因显现而产生优良性状，使具有重要经济性状的显性基因转为纯合状态，雌核发育后代还可用来鉴定鱼类的近交衰退现象等。蒋一硅（1982）等和吴清江（1981）等曾分别成功地应用γ射线辐射鱼类精液后诱导红鲫鱼卵和鲤鱼卵的雌核生殖。蔡难儿（1995）首先报道了采用与研究鱼类人工诱导雌核发育相类似的四步诱导法对中国对虾进行人工诱导雌核发育，育出三批雌核发育的个体，但要大规模生产仍存在一定的困难。李胜忠等（1997）采取热休克的方法诱导虹鳟二倍体雌核发育，三次实验均获成功。美国为了限制移植的草鱼和白鲢的种群繁殖，用紫外线处理过的鲤鱼精子诱导白鲢卵的雌核发育，再经温差休克处理，获得了雌核发育鱼，但同样存在受精率和孵化率低的问题。

　　2．3 细胞核移植

　　细胞核移植技术是将一细胞核移植到另一去核的未受精卵或细胞内的生物技术。我国著名生物学家童第周等率先在金鱼和鱼中进行同种鱼的细胞核移植，随后在这两种鱼间进行了不同亚科之间的细胞核移植，获得了多种移植的核质杂鱼。Yan（1985）等成功地进行了真骨鱼类中两种不同亚科种类之间的核移植，即将草鱼的细胞核移植到团头鲂的细胞质，获得了核质杂交鱼。其外表特征与草鱼相似，说明遗传信息的表达主要是受移入的鱼细胞核的影响，而且核质杂交鱼的生长率比草鱼略快但比短吻鳊要快得多，其生产的精子可与草鱼卵回交并获得了后代。林礼堂等（1996）把鲫鱼、鲮鱼和尼罗罗非鱼的体细胞核移植到鲤鱼的成熟去核卵中获得了不同发育阶段的胚胎和幼鱼。目前，我国在鱼类细胞核移植技术的理论研究和实际应用方面都居世界领先地位。

　　2．4 细胞培养技术

　　细胞培养技术是把生物的细胞分离、培养、诱导再生或快速繁殖的技术。目前这项技术已广泛应用于鱼类细胞、珍珠贝外套膜上皮细胞以及海藻细胞等的培养。水产动物细胞培养起始于鱼类，同时以鱼类细胞培养研究开展得较为系统，已建立的鱼类细胞系也较多。这些细胞系具有多方面的用途，可代替活体动物用于病毒研究，可用于染色体制作等遗传学研究，用于制作细胞疫苗，作为细胞核移植育种研究中供体细胞核来源，以及毒性和水质监测等的指示生物（细胞比鱼体对有毒物质更敏感）等。张念慈等（1981）建立了草鱼吻端组织二倍体ZC-7901细胞系，陈敏容等1985年建立了鲫鱼异倍体细胞系CAB－80，左文功等1986年建立了草鱼肾组织CIK细胞系，童裳亮等1989年建立了虹鳟巨噬细胞系。与鱼类相比，贝类、虾类等水产动物的细胞培养研究国内外报道较少，如Hanson等1976年建立了淡水蜗牛胚胎细胞系，徐亚立等最近建立了斑节对虾PMO细胞系。

　　3 疾病诊断技术

　　3．l 单克隆抗体技术

　　单克隆抗体技术是K和M于1975年发展起来的利用杂交瘤细胞制备大量针对某一抗原决定簇的特异性抗体的技术。单克隆抗体与常规血清抗体相比，特异性强，能识别单一抗原决定簇，且容易制备，能保持细胞系重复获得相同抗体，因而在水产养殖病原体检测中得到广泛应用。如应用于诊断海湾扇贝的鳃立克次体、诊断与鱼类及牡蛎相结合的淋巴细胞病毒、检测菲律宾蛤仔棕环病因弧菌P1。另外，近年来已有人利用此技术制备了抗鳗弧菌的单克隆抗体的抗嗜水单胞菌外毒素的单克隆抗体。

　　3．2 酶联免疫吸附检测

　　酶联免疫吸附检测（EL1SA）是将抗原一机体的免疫反应和酶的催化反应相结合的技术。其基本原理是将抗原或抗体吸附于固相载体上，然后与酶标记的抗原或抗体结合，在适当的底物参与下，使基质水解而呈色，通过呈现的颜色变化来显示抗原抗体特异反应的存在。ELISA具有灵敏度高、特异性强、反应快速等特点，而且结果可以定量，也可对抗原、抗体以及抗原抗体复合物进行定位分析。ELISA法已用于IPNV、VHSV、CCV、PERV、SVCV、GCHV及IHNV的检测中。随着技术方法的不断更新和改进，特别是单克隆抗体等的应用，使检测灵敏度和异性大幅度提高（Ristow et al，1991）。Davis（1994）等结合细胞培养技术检测IPNV，大大增强了检测的特异性、敏感性和客观性。

　　3．3 核酸杂交技术

　　核酸杂交技术是利用特定标记的DNA或RNA探针和病原体生物中的与探针互补的靶核苷酸序列进行杂交，以此来确定宿主是否携带有病原体的一类分子生物学技术，可分为Southern杂交、Northern杂交和核酸原位杂交。该技术以其灵敏度高、特异性强和检验快速等优点，近年来在对虾病毒等水产养殖病原体检测中倍受青睐。Subramanian（1993）利用所合成的CDNA探针，通过核酸杂交试验检测感染细胞和组织中的水和呼肠弧病毒的dsDNA获得成功；Lupinai等（1993）应用制备的RNA探针通过RNA－RNA印迹杂交法分离鉴定出一种新的病毒即水生呼肠弧病毒A群。Dopazo （1994）等将制备的cDNA探针用于IPNV的检测和诊断，从接种病毒4～8h的培养细胞中即检测到IPNV。

　　3.4 PCR技术

　　聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成迅速扩增特异DNA片段的一种方法。在鱼类等动物疾病诊断中PCR技术的应用才刚刚开始，就已经显示出其巨大的潜力及广阔的应用前景（Davies etaL 1994）。Arakawa（1990）等应用PCR技术检测了虹鳟鱼IH－NV，并以生物素标记的寡核苷酸探针鉴定了产物的特异性。Boyle （1991）等用PCR法检CCV的DNA，灵敏度达0．lpg，并成功地检测出CCV携带者。Lastra（1994）等应用逆转录聚合酶链式反应（RT－PCR）对经培养细胞分高纯化的病毒进行检测，灵敏度达到lpg；另外，他们还对银大马哈鱼、鳟鱼组织中的IPNV进行检测并进行扩增。对于其它水生动物病毒的检测，早在1990年就有关于应用PCR技术从对虾组织中检测出核型多角体病毒的报道（Vickers，1990）。Chang等利用PCR技术首次成功地进行对虾病毒的扩增。Wang等（1996）用PCR方法检测对虾杆状病毒，并获得了预计的扩增产物。此外，应用PCR技术也可检测贝类肠道病毒以及水或水生生物体内富集的病毒或细菌。

　　4 免疫防治技术

　　4.1 免疫增强剂

　　包括特异性免疫和非特异性免疫增强剂，但更多的是增强非特异性免疫机能。其主要是通过活化自身的免疫机能而显示机体的防御效果，具有作用广泛、安全性高等特点。免疫增强剂的功能是多方面的，在甲壳动物中，可活化血淋巴中的吞噬细胞，提高吞噬病原菌能力；刺激血淋巴中抗菌、溶菌活力的产生或升高；激活酚氧酶原系统产生识别信号及介导吞噬等。在鱼类中，可激活嗜中性粒细胞及巨噬细胞的吞噬作用；激活淋巴细胞产生或分泌淋巴因子以协调体液免疫和细胞免疫；刺激抗体的产生和补体的生成等。目前应用较多的免疫增强剂主要有葡聚糖、脂多糖、细菌多肽、左旋咪华、几丁质、鸡蛋产物、维生素和激素等。Hardie等 （1991）讨道给予大量维生素C的鱼类，其补体活动水平得到提高。大西洋鲑鱼经注射酵母葡聚糖后，也表现出补体活动得到提高（Engstad etal．1992）；使用免疫增强剂也能够影响溶菌酶的活性，溶菌酶是一种水解酶，存在于鱼类的粘液、血清和巨噬细胞中，能杀死病原微生物而使鱼体获得保护（Engstad et al．1992）。此外，NK细胞也能被生长激素（Kajita et al．1992）和左旋咪华（Kajita et al．1990）所激活。

　　4.2 DNA疫苗

　　在水产动物疾病防治上，传统的疫苗是用灭活菌体疫苗或弱毒性的菌体疫苗，前者往往效果不明显，后者却仍可造成轻微感染或回复突变为病原株的危险。DNA疫苗又称基因疫苗或核酸疫苗，它是将病毒或微生物中负责转译抗原蛋白的基因片段分离出来，在体外与载体连接形成重组DNA，然后转移入宿主细胞，在宿主细胞内表达抗原蛋白，达到免疫的效果。这种疫苗制备方法简单，成本低，适宜大规模生产，它在体内能长期表达，不断刺激机体的免疫系统，可组成多价疫苗，即一种疫苗能诱导产生针对多个抗原表位的免疫保护作用。鱼用DNA疫苗主要针对的是病毒性鱼病，目前研究应用的有出血性败血病毒（VHSV）、传染性造血组织坏死病毒（IHNV）、传染性胰脏坏死病毒（IPNV）、鳗鱼病毒（EVA、EVEX）、草鱼呼肠弧病毒（FRV）、文蛤病毒等疫苗。Lorenzen （1999）针对VHSV病毒G蛋白构建的DNA疫苗能够诱导70％的虹鳟产生较高水平的免疫保护性。Traxler（1999）等以编码IHNV病毒G蛋白（PCMV4－G）的裸DNA免疫大麻哈鱼，8周后，用IHNV病毒攻击，保护率可达40％～100％。当然，DNA疫苗作为一代新型疫苗，还有不完善的地方，其中最引人关注的是安全性问题，人们担心DNA疫苗会整合到宿方的染色体上造成插入突变，不过目前在实验中尚未发现这种现象。

　　4.3 反义技术

　　反义技术是近十多年来发展起来的反义核酸技术和核酶技术的总称，可以用来特异性地阻断病毒功能的发挥。反义核酸可分为反义RNA技术和反义DNA技术，但一般常指反义RNA技术。反义RNA是以DNA有义链为模板合成的RNA及其衍生物，它可通过与相应的mRNA互补结合而阻断其功能。1985年首次将病毒存活所必需的酶基因或结构基因的反义核酸和表达载体连接，转入细胞内或将反义核酸直接注入细胞，发现者对病毒有抑制作用。目前，使用人工合成的反义RNA已在原核细胞和真核细胞中成功地抑制了多种病毒基因的表达。核酶则是一种具有催化作用的RNA，它通过碱基配对与靶RNA相互识别。结合并催化水解靶RNA，因此它既有反义RNA的作用，又能以序列特异性地切割RNA。实验证明，核酶也可以抑制病毒的复制和表达，转入基因可以传代，现在已有不少研究显示核酶可用于对病毒靶RNA进行切割。不过目前还未见到有关成功应用反义技术来治疗水产养殖动植物病毒性疾病的报道，但作为一种特异性较强的检测技术，反义技术是很有开发潜力的。

　　5 环境生物修复技术

　　水生环境日趋恶化，对渔业造成极大危胁，病害的暴发主要是由环境污染所造成的。环境生物修复技术是一个新的研究发展领域，国外采用生物修复技术改良水生环境，已取得新的进展。所谓环境生物修复技术就是利用生物制剂去除水生环境中的有害废弃物，应用微生物的机理，降解多种污染物，改善水生环境。生物修复是比生物降解含义更为广泛，又以生物降解为重点的环境生物技术。其方法包括利用活机体、或其制作产品降解污染物，减少毒性或转化为无毒产品，富集和固定有毒物质（包括重金属等），大尺度的生物修复还包括生态系统中的生态调控等。这种生物技术可以应用水产规模化养殖和工厂化养殖、石油污染、重金属污染、城市排污以及海洋其它废物（水）的处理等方面。关于微生物对环境反应的动力学机制、降解过程的生化机理、生物传感器、海洋微生物之间以及与其它生物之间的共生关系和互利机制，抗附着物质的分离纯化等领域的研究有待于进一步深入。目前已进行的研究有：研究转重金属硫蛋白基因藻类对海水环境中重金属的吸附能力；五油降解微生物在修复被五油污染的水环境上的可行性及应用潜力；海洋磁细菌在去除和回收海水环境中重金属上的应用潜力；用杆状菌清除养鱼场污水中的氮，用分子技术筛选作为海水养殖饵料的微藻，分离出耐冷的癸烷降解细菌，研究了海洋环境中多芳香化烃的微生物降解技术。

　　6 结语

　　总之，水产养殖是一门应用学科，其发展不只是依靠本学科的技术，更重要的是需要综合生物技术，其中包括：遗传学、营养学、病理学、内分泌以及生物工程等。在解决某一养殖对象的关键技术问题时，均涉及高新综合性生物技术，所有这些生物技术的应用，无疑对渔业的发展产生着深远而深刻的划时代意义。