农业农村部农业主推技术：多种对虾病毒的现场快速高灵敏检测技术

　　技术概述：

　　我国养殖虾类产量在2008年达到198万吨，占世界总产量的40%以上，对虾病毒病爆发给我国对虾养殖业造成损失在50亿元以上;开展对虾苗种病毒检测是避免病毒病大规模爆发流行减少损失的重要途径。

　　环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是2000年由Notomi 等发明的一种全新的等温扩增技术。通过开展LAMP技术检测对虾病毒的研究，中国水产科学研究院黄海水产研究所成功开发出实用性强、特异性高的对虾白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、斑节对虾杆状病毒(MBV)、黄头病毒(YHV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、凡纳滨对虾诺达病毒(PvNV)、对虾杆状病毒(BP)等十多种虾类病毒的系列核酸等温扩增检测技术;同时，通过研发核酸快速制备、染料固定化等配套技术，目前已经建立了上述病毒的现场快速高灵敏检测技术并研发生产了相关检测试剂盒。

　　此技术具有如下优点：

　　(1)灵敏度高，对病毒的检测可低至10个拷贝，其灵敏度比普通PCR方法高100倍以上;

　　(2)特异性强，所用的检测引物均是依据病毒保守基因中6个不同区域设计，特异性超过常规PCR;

　　(3)检测时间短，从核酸制备到检测完成只需1个小时;

　　(4)仪器要求宽松，不需要复杂的仪器设备，只要一个水浴锅或金属浴，甚至一暖壶开水和一个温度计就能完成检测反应。

　　(5)操作简单、结果明显。整个检测过程不涉及复杂仪器或设备，稍具分子生物学基础的人员即可完成操作;检测结果清晰明显，直接用眼睛观察就可以判断。

　　(6)对人和环境安全。检测过程中不使用有毒试剂，对人和环境都非常安全。

　　(7)低成本。 LAMP检测总成本大大低于现有最廉价的PCR检测方法。

　　目前，该项技术已申请国家发明专利20项，获得授权14项。

　　增产增效情况：目前，利用上述检测技术已经完成了对来自辽宁、天津、河北、山东、江苏、浙江、福建、广东、广西等省市的800多份对虾样品的检测。检测结果显示，核酸等温扩增检测方法比PCR检测方法具有更高的灵敏度和可靠性。并且，该检测技术不涉及有毒的试剂，对操作人员健康和环境保护都非常友好;与之前对虾病毒检测技术相比，该项技术除对仪器设备无特殊要求外，还能使检测成本降低50%以上。

　　技术要点：

　　1.取对虾个体(仔虾、幼体和幼虾)或对虾鳃丝或附肢(成虾)样品约磨碎至浆状;

　　2.用牙签蘸取浆状的样品分别采样用膜片充分润湿;

　　3.用吸管吸取A液，滴于的采样用膜片上;

　　4.取新牙签将上述采样用膜片漂洗3~4 分钟;

　　5.采样用膜片、阳性及阴性对照膜片于95℃保温4 分钟，迅速置于冷水中2分钟;

　　6.将上述膜片转入反应液中57~60 ºC保温50分钟;

　　7.将反应液于90~95 ºC保温2分钟;

　　8.观察反应液颜色，如果显示绿色则表示该样品的病毒检测结果为阳性，如果显示橙黄色则表示该样品的病毒检测结果为阴性。

　　适宜区域：适于在现场、水产养殖企业、相关各级实验室使用，尤其能够满足技术力量相对薄弱的对虾育苗、养殖单位开展现场检测的需要。

　　注意事项：

　　1.因该检测技术的灵敏度非常高，所以检测过程应严格按照操作指南进行，反应结束后不能打开扩增检测管，以防反应产物溅出污染后续检测样品导致假阳性的出现。

　　2.黑色背景更利于实验结果的观察。扩增反应结束后，可利用试剂盒说明书中提供的黑色背景进行观察。

　　技术依托单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所