大规模养殖鱼类口服疫苗的开发方法

　　摘要：目前，批准在人类和动物物种上使用的口服疫苗数量有限，开发有效安全的口服疫苗对鱼类免疫学家一直是一个挑战。口服疫苗效果不佳的重要原因是由于恶劣的胃环境对抗原的破坏，以及肠道环境的高耐受性和疫苗设计方法的不足。在本文中，我们讨论了目前大规模养殖鱼类口服疫苗的开发方法;借鉴人类和兽医疫苗的开发经验，从鱼类粘膜免疫学和新分子生物学的最新进展的角度，提出了鱼类口服疫苗的设计方法;并讨论了用斑马鱼作为预筛选动物模型的优点和缺点，旨在加快养殖鱼类疫苗的设计和验证。

　　1、引言

　　目前，用于养殖鱼类的疫苗绝大多数是针对细菌病原体，只有少数是针对病毒的。目前市售疫苗的给药途径是口服(通过混饲)、浸泡、腹腔注射(ip)或肌肉注射(im)。虽然注射接种疫苗对鱼的保护最有效，但操作难度较大。腹腔注射通常用于给予水包油型注射疫苗，而肌肉注射最常用于给予DNA质粒。水包油型注射疫苗会产生局部副作用，包括组织炎症、组织粘连或组织坏死。鱼太小或不能注射接种疫苗的，可通过口服或浸泡接种疫苗，但这些方法通常效果不佳、保护周期短。目前，也有开发出浸泡、口服和注射组合使用的疫苗接种方法来确保整个周期都能受到疫苗的保护。

　　口服疫苗免疫还存在诱导耐受后的潜在风险，特别是免疫功能不成熟的幼鱼，因此，鱼类免疫学家考虑正在发展的粘膜疫苗。从动物的福利和处理成本来看，鱼用口服粘膜疫苗，将是疫苗接种的理想方法，但还没有通过此途径实现大规模疫苗接种。

　　本文在总结人用和兽用口服疫苗的基础上，将粘膜免疫应用于鱼用口服疫苗研制，特别在抗原的类型、剂量、灭活等方法上的研究。首先，通过探索病原体的性质、鱼体性质和疫苗接种方面的共性，剖析鱼口服传递抗原耐受的可能条件。其次，从免疫保护机制入手，针对抗原耐受性问题和实现疫苗口服问题进行解决。再次，针对局部抗原呈递细胞(APC)和M细胞进行探究，选择出促进抗原粘附于M细胞或强烈激活局部非特异性免疫和特异性免疫应答的粘膜免疫佐剂。

　　2、人类和兽用疫苗的研究现状

　　在哺乳动物中，胃肠外抗原给药会触发弱的粘膜反应，而在粘膜表面的抗原给药会有效地触发局部以及全身性的体液和细胞介导的反应。在粘膜表面触发对粘膜病原体的特异性免疫反应保护的重要性是公认的。

　　经100多年研究，被批准的人用粘膜疫苗仅有5个，包括四个口服疫苗，预防小儿麻痹病毒，轮状病毒，沙门氏菌，伤寒和霍乱及一个鼻用抗流感病毒疫苗。

　　商业化的鱼类病原体的口服疫苗目前仅有大西洋鲑和银鲑商业口服疫苗、大扇贝口服疫苗，前者用于抵御鲑鱼立克次氏体、胰腺感染性病毒和传染性鲑鱼贫血病毒、虹鳟抗胰腺感染性病毒、彩虹鳟鱼和鲈鱼抗鳗弧菌;后者用于抵御加氏乳球菌。但与人类口服疫苗类似，鱼用口服疫苗只能提供弱效或短期的保护。

　　3、当前成功的和受关注的人类及兽医粘膜疫苗

　　所有许可使用在人类和兽医物种的口服疫苗都是针对粘膜病原体，这些粘膜病原体要么感染粘膜表面本身，要么以粘膜为入口，再进行全身性感染。

　　只有少数成功的口服疫苗是在减毒活的病毒或细菌的基础上，模仿病原体感染的途径，并触发强大的局部免疫反应，且不需要任何额外的佐剂。减毒活疫苗的特点是安全性差，原因是不能保证病原体不会恢复到致病状态以致易感人的发病。

　　出于方便和安全性的考虑，鱼类口服疫苗的抗原研究集中于使用灭活病原体(加热或甲醛灭活)，虽没有具体提到是否给予佐剂，但大多数疫苗都加入了抗原传递系统保护载体，旨在避免抗原在胃降解，也可能促进抗原粘附粘膜表面，或可能作为局部的炎症信号。灭活病原体的优势是相对安全，但其保护是弱效和短期的且与血清IgM水平有关，而疾病易感与血清IgM水平下降有关。另有报道，重复口服给药(灭活病原体)可保证鱼体在整个生产周期中的高血清IgM，说明口服抗原可以引起全身反应，但也说明鱼没有建立强大的记忆效应和形成耐受性。

　　4、非胶囊化鱼类口服疫苗研究策略与效果

　　现有的对疫苗效果研究报道主要包括，第一，鉴于目前成功许可的鱼用疫苗，以及灭活病原体的方便性和安全性，大量的研究集中在使用非封装(灭活的)细菌、酵母或植物表达细菌或病毒抗原。这种策略是基于细胞壁本身可能作为对肠道环境的自然保护屏障的假设成立下，在整个细胞中表达的抗原可能不需要进一步的封装。第二，在测试的时间(多为2-3个月)内，按剂量连续给药可实现足够的诱导响应并赋予保护，但多数只研究到最后一次免疫后的10～30天。第三，在剂量相同的情况下，添加佐剂的疫苗，可以增强疫苗效果。使用不同类型的细胞疫苗，与无佐剂的相同疫苗比较，添加25% V / V 10%钾硫酸铝可增加虹鳟对鳗弧菌的抵抗力。第四，肠道微生物可能是合适的疫苗载体，共生可以维持他们定居肠道并在粘膜表面持续传递抗原的能力。

　　尽管存在很多有前途的方法，但仍然很难系统的解决使用剂量、疫苗类型、疫苗效能的长期保护(>3个月)等问题，且大多数研究中的病原体感染没有采用自然的感染途径。

　　5、胶囊化口服疫苗的研究对策与效果

　　对比前面提到的细菌或酵母和植物疫苗，很多更脆弱的疫苗如DNA质粒，纯化的重组蛋白和亚单位疫苗，的确需要一种保护形式。在许多动物物种中，可溶性的、非粘附的抗原通常在低水平时被占用，若在肠道中，这种抗原通常引起免疫耐受。相反，通过粘附聚合物或耦合到自身粘附于上皮表面的蛋白质上得以保留在粘膜表面的抗原可增强粘膜的免疫反应。在小鼠和其他几种动物上的研究清楚表明，微胶囊化的疫苗对于粘膜递送具有优势，表现在：M细胞特别容易将微粒主动运输到由小肠粘膜远端大量淋巴滤泡组成的集合淋巴结，小微粒(直径1毫米)粘附到M细胞的利用效率最高。此外，绒毛上皮细胞顶面、集合淋巴结滤泡相关的上皮细胞和M细胞上的特殊糖脂和蛋白糖链在抗原粘附方面发挥了至关重要的作用。已发现，大西洋鲑鱼肠道有类似哺乳动物的M样细胞，这些细胞在功能上是等价的，但表型不同。可以肯定，微胶囊技术可以用于进一步提高上述灭活细菌、酵母或植物疫苗的吸收。

　　但需要注意，接种疫苗的最大剂量受制于日采食量和疫苗微囊化后的包封率，而包封率在很大程度上取决于被选择封装的载体与细菌结合的状态和生物包埋后的稳定性。疫苗的剂量和暴露时间，特别是在幼龄动物，对疫苗疗效是非常关键的，这些因素确定能导致免疫应答或耐受的差异。一些聚合物，如壳聚糖、乳酸-乙醇酸(PLGA)、海藻酸盐、脂质体已经应用于微囊化疫苗，例如，海藻酸盐包裹减毒或无毒的活肠道病原菌和病毒后，在通过消化道时，藻酸盐的驻留能保护微生物和质粒，并且通过肠道粘液层扩散，从而达到细胞表面，与上皮细胞接触，藻酸盐可被抗原细胞摄入，并传递微生物或DNA质粒，肠道病原体有可能激活局部粘膜反应，而DNA质粒可以进入细胞核，采用类似在病毒感染过程中的方式来触发抗原表达。

　　6、鱼用口服疫苗的合理免疫方法

　　毫无疑问疫苗触发适当的免疫途径是对抗病原最有效的方法，但这种适当的免疫反应是如何实现的呢?

　　病原体引发全身体液免疫反应是适当的保护，灭活微生物、蛋白佐剂疫苗、病毒样颗粒或其他亚单位疫苗足以引发足够的全身性免疫反应。

　　然而，从目前的研究来看，专门引起全身性体液免疫的疫苗，可能不是有效的对粘膜(肠道)的病原体，因为肠外免疫难以有效地引起粘膜反应。

　　在人类和其他兽医物种，减毒活的病原体(细菌或病毒)和非复制的DNA质粒已被开发出来，在强佐剂存在下通过肠外途径可引起全身性的细胞介导的T细胞反应。最重要的是，抗原在宿主的复制和疫苗佐剂的存在会引发局部免疫细胞和抗原递呈细胞活化，免疫细胞的激活是抗原呈递给CD8+T细胞，通过MHC-I类途径以及呈递给CD4+辅助性T细胞通过交叉性途径来实现。病毒粒子在APC表面的表达也会激活抗原特异性B细胞。Th1细胞分泌IFNγ将进一步维持B细胞活化，产生抗体。因此，这样的反应有助于激活一个完整体液效应，并触发病毒或其他细胞内病原体的细胞介导反应。有趣的是，DNA质粒，虽不能在宿主细胞中复制，但已被证明可有效地触发免疫系统，特别是在鱼类，其使用剂量可比哺乳动物低100倍。一般认为，鱼类的免疫机制是保守的，体液和细胞介导的免疫反应与全身和粘膜免疫接种保护有关。血清IgM水平与疫苗接种方法相关，特别是对于细胞外病原体。近年来，在鲫鱼和鳟鱼对T细胞标记CD8和CD4的单克隆抗体开发就很好的说明了T细胞对感染和接种疫苗的反应。另外，2005年，在鳟鱼上发现一个新的免疫球蛋白类型命名为IGT，可更好地描述鱼类疫苗与系统和粘膜反应。最近对鱼类粘膜免疫机制的研究也有报道。

　　7、口服疫苗触发保护性体液免疫和细胞介导的反应

　　要触发保护性体液免疫和细胞介导的反应，应从以下几方面考虑：

　　首先，M样细胞和抗原呈递细胞靶向作用于鱼肠道。当抗原或疫苗通过口服途径给药，它们与共生的肠道微生物都会面临着同样的宿主防御机制。口服疫苗需克服胃环境、蛋白酶或核酸酶的攻击，并穿透厚厚的黏液到达上皮屏障。因此，需要口服大量抗原，因为不可能精确确定到达上皮层的抗原数量。只有疫苗与顶端上皮细胞接触，才可以被摄取并传递到基底侧，抗原递呈细胞才能处理它。在哺乳动物，抗原需先经摄取后，由M细胞传递给滤泡相关上皮细胞和绒毛上皮细胞的顶端部分。M细胞利用细胞质运输的囊泡将细菌、病毒、可溶性微生物产物或颗粒抗原传递到基底膜的白细胞。M细胞形成一个白细胞可以聚集在内的“口袋”，“口袋”减少了顶端和基底之间的距离，从而提高抗原到达白细胞的效率。除了M细胞，专门的树突状细胞通过上皮层延伸直接在管腔内释放抗原。在激活局部免疫反应时，M细胞和上皮的树突状细胞成为疫苗交付的直接目标。已有报道，鲑鱼上皮层内具有一定数量的M样细胞，向管腔侧延伸胞质突起并摄取BSA微粒。虽然M样细胞的特异性标志物在鱼类中尚未确定，但有报道，鲑鱼M样细胞类似于哺乳动物的M细胞，在荆豆凝集素(UEA-1)中为阳性，在麦胚凝集素(WGA)中为阴性。UEA-1的单个阳性细胞仅见于绒毛粘膜褶皱深处，而不在顶部区。虽白细胞不在基底的“口袋”，但认为巨噬样细胞与基底侧的M样细胞相关。已证明鱼类肠道和上皮的巨噬细胞在第二肠段的抗原摄取中发挥作用。上皮内巨噬细胞能有效地摄取和运输抗原，尤其是当抗原结合到肠道粘附分子上。另外，在外周部位也能观察到能运输抗原的游离巨噬细胞。鱼类巨噬细胞的标记物仅存在于少量鱼种中。然而，它们可作为模型鱼类中假定的APC的特有目标，证明细胞特异性抗原传递途径的适应性。

　　其次，考虑诱导免疫耐受和抗原剂量的关系。在哺乳动物中，体内存在着内在平衡机制，即免疫耐受和免疫效应，是设计口服疫苗的主要障碍。已有报道，调节性T细胞的诱导和耐受与抗原剂量相关。在哺乳动物中，高剂量的口服抗原会诱导失效和抗原特异性T细胞的缺失，而低抗原剂量会触发T细胞发育。在鱼类，虽耐受性诱导机制还没有系统的解释，但抗原的剂量和给药途径也与耐受性相关。由于难以精确确定粘膜表面的抗原量，很难在规范条件下判定该疫苗会不会产生耐受性。从口服疫苗发展前景来看，疫苗抗原不应仅是在固有膜内传递到抗原呈递细胞，而且应该有较强的能打破肠道耐受性的刺激信号。因此使用强大的黏膜免疫佐剂疫苗或复制型疫苗会更有帮助。

　　再次，模仿病原体进入并激活粘膜反应。模仿病原体制备的疫苗包括：以减毒肠道致病菌作为疫苗载体的减毒活疫苗，包裹的DNA质粒和激活有效的粘膜免疫应答，重组减毒活疫苗载体。

　　8、合理的疫苗设计和未来疫苗的新方法

　　近年来，采用活病毒载体作为疫苗载体，是设计疫苗新的方向。这些活病毒载体包括杆状病毒、甲病毒、腺病毒等。它们具有一些共同点：1)可以被修饰并在自然物种上使用而不具有致病性;2)能够在真核细胞中递送核酸，由宿主细胞自身允许疫苗抗原表达;3)通过假型化的病毒，可以设计成靶向作用于被感染细胞;4)简单的克隆和变异策略。

　　9、目前最理想的口服疫苗的改进方法：粘膜佐剂

　　在口服给药时，非复制的抗原，如可溶性蛋白，质粒DNA的免疫原性很差，因为它们无法引发适当的炎症刺激信号。有效的粘膜免疫佐剂的使用可以大大提高这些疫苗的有效性。这些佐剂，包括以下几种，一是借鉴人用或其他物种疫苗的传统佐剂，如明矾、弗罗佐剂、脂质体、皂苷、角鲨烯等;二是肠毒素，肠毒素及肠病原体本身，无论是作为活的传递载体还是灭活的病原体，都可提供足够的刺激信号,都可用于口服免疫制剂的佐剂;三是分子佐剂，即以DNA质粒编码分子或以RNA为基本成分的载体分子作为分子佐剂是可能的，但从目前来看，这些分子佐剂用于鱼类的口服免疫还很局限。四是基于PAMPs的粘膜佐剂，在鱼类研究中，关于模式识别受体、清除剂受体及C型凝集素的鉴定及特征性描述已取得一定进步，可为合理佐剂设计提供方向。已有报道，聚肌胞苷酸(poly I:C一种干扰素诱导剂)比较适合作为鱼类疫苗佐剂，但用于口服疫苗佐剂仍需要评估。五是以植物蛋白作为免疫刺激剂打破粘膜耐受性。

　　10.关于鱼的习性和环境因素的考虑

　　已有研究表明，选择与鱼环境相匹配的封装方法是十分重要的。在饲养条件下，测试疫苗对靶动物是否有效，与鱼种、所处环境差异及养殖条件有重要的关系。因此，水产养殖动物口服疫苗的设计，应尽可能考虑不同鱼种的生活环境和饮食习惯的差异性。

　　11、斑马鱼作为水产动物的动物模型

　　疫苗验证须在合适的物种和其自然生长环境最相似的条件下进行。采用斑马鱼为模型有助于我们尽快搞清楚有关疫苗的特征和宿主的免疫反应，例如，口服传递抗原对吸收、分布和激活的免疫反应有相对贡献的特定细胞类型等的信息。已有以斑马鱼肠道生理和其潜在应用为模型进行研究报道。斑马鱼可以证明采用新方法开发的口服疫苗的有效性，有助于加速抗原、佐剂、疫苗传递载体和封装方法的选择。

　　当然，使用斑马鱼作为模型在水产养殖物种中仍有一定的局限性。由于杂食动物和食肉动物的肠道菌群和肠道环境的不同，斑马鱼是鲤科和淡水鱼类的合适模型，但不太适合作为鲑鱼、鳟鱼、大菱鲆、鲷科鱼类或鲈鱼的模型。

　　12、结语

　　借鉴人类和兽医口服疫苗方面所取得的成功，鱼类口服疫苗可从中吸取经验。由于养殖鱼类的物种及其病原体的多样性，现有口服疫苗难以满足市场需求。尽管在过去30年中，已有一些有关鱼粘膜免疫学的研究，但仍处于起步阶段，这与硬骨鱼类的物种差异性大有关。

　　近5～10年，鱼粘膜免疫也有新发现，包括IgT或M样细胞、粘膜免疫学和疫苗学，结合对鱼内脏的研究表明，M样细胞或抗原呈递细胞将为鱼类疫苗给药提供一种可行的选择。

　　从分子印迹技术和遗传学的角度，斑马鱼动物模型可加快鱼类疫苗开发，类似其他动物模型有助于人类和兽医领域。对于如何接种口服疫苗、以及设计突破粘膜耐受性的策略，宿主粘膜反应和鱼类肠道微生物群的信息是必不可少的。另外，学术界的同行和养殖户之间协作，对生产商业安全有效的鱼用疫苗也是有帮助的。

　　来源：Oral vaccination of fish: Lessons from humans and veterinary species，Developmental and Comparative Immunology 64 (2016) 118-137

　　唐晓莹 徐静等

　　本稿为水产养殖动物疾病防控技术国家地方联合工程实验室原创编译整理