南美白对虾“早期死亡综合症”的发病特点及防控

海南大学，海南  海口，570228
 
　　自2009年以来，南美白对虾“早期死亡综合症”（Early Mortality Syndrome）在亚洲地区爆发并蔓延，给亚洲各国的对虾养殖业带来了巨大的经济损失。最近也有学者将该病称为“急性肝胰脏坏死综合症”（Acute Hepatopancreas Necrosis Syndrome）。有关南美白对虾“早期死亡综合症”的研究已有报道，如Flegel T.W. 、Lightner D.、Eduardo M. Leano等曾报道南美白对虾“早期死亡综合症”的主要发病症状和致病的可能性因素，但对于该病的原发性病原和病因至今尚未有确切的定论。

　　1 南美白对虾“早期死亡综合症”的发病特点
 
 
2010～2012年期间，笔者在海南调研了大量发生“早期死亡综合症”的虾塘并走访了众多的养殖户，通过现场的观察、采样检测及与养殖技术人员的交流，发现不同地区和不同季节发生的“早期死亡综合症”都有许多相同的发病特点。并采集了放养30天左右摄食生长正常的和患“早期死亡综合症”的南美白对虾活体样品。正常组对虾采自海南省文昌市林梧养殖场的6口池塘，患病组对虾采自海南省澄迈县的马村养殖场和南港养殖场的6口池塘。对虾样品通过无菌操作和低温保存，带回实验室分别进行肝胰脏和中肠组织切片、肝胰脏的弧菌和可培养细菌的检测，并采用PCR（聚合酶链式反应）方法检测白斑综合症病毒（WSSV）、桃拉综合症病毒（TSV）和皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）三种特定病毒。现将“早期死亡综合症”的发病特点和相关的实验结果归纳整理如下，旨在为南美白对虾“早期死亡综合症”的防治及流行病学的研究提供参考。
 
 
　　1.1  对虾“早期死亡综合症”的主要外观症状
 
虾苗放养10-30天为该病的高发期，患病对虾体色呈白浊并微红，多数情况下肝胰脏异常肿大，质地松软，颜色呈淡白或淡黄色；部分患病对虾的肝胰脏明显萎缩，质地变硬（图1）。发病期间，患病对虾通常在池塘水面缓慢游动或趴伏于池塘边坡上，失去食欲，胃、肠充塞度极差，严重者胃肠呈红色。该病病情发展十分迅速，死亡率和排塘率极高，从发现少量病虾到排塘，时间最短的仅2-3天。患病对虾样品经PCR方法检测，通常未被检出携带WSSV、TSV、IHHNV等特定病毒，但肝胰脏和肠组织匀浆经TCBS培养基的培养，均被检测出有大量的弧菌。对虾的发病通常与虾池藻类的老化死亡有密切关系，检测池水的弧菌数量较大，且往往是绿色弧菌占绝对优势。美国亚历桑那大学的Lightner教授在2012年8月的曼谷研讨会上指出，到目前为止，从越南和中国采集的患病对虾样本的组织滤液在人工感染试验中无法证实该病是由病毒引起的，病虾样品的PCR测试结果显示，“早期死亡综合症”与白斑综合症病毒、黄头病毒、传染性肌肉坏死病毒和桃拉综合症病毒没有直接的关系。2013年3月，拜耳（四川）动物保健有限公司的刘涛博士应Chalor教授的邀请前往泰国农业大学参观访问，据Chalor教授介绍，他们的实验中心在一年多前就尝试用病虾作为实验材料开展人工感染试验，甚至用病虾的肝胰脏匀浆滤液注射到健康的对虾，其结果也不能导致健康对虾的发病，认同“早期死亡综合症”不是由病毒引起的观点。

 
图1  示患病对虾肝胰脏的肿大和萎缩
 

　　1.2  对虾肝胰脏和中肠的组织学观察
 
 
 
　　通过显微镜观察，发现正常对虾和患病对虾肝胰脏和中肠的组织形态有很大的差异。正常对虾的肝胰脏为复管状腺，由多级分支的肝小管组成，肝小管管壁由单层细胞构成，管腔呈五角或四角星形，腺细胞正常（图2）；中肠管壁组织厚度均匀、致密，肠腔中充满内含物（图4）。患病对虾肝胰脏的腺细胞间隙变大，腺细胞核变小，腺细胞有不同程度的自溶现象，肝小管变形（图3）；中肠肠壁变薄，肠粘膜脱落并散落于肠腔内，肠腔中没有内含物（图5）。
图2 正常南美白对虾的肝小管横切面  


　图3 患病南美白对虾的肝小管横切面


图4正常南美白对虾的中肠横切面



　 图5患病南美白对虾的中肠横切面  

　　1.3  对虾肝胰脏弧菌和可培养细菌的数量
 
 
 
　　通过对生长正常和患病对虾的活体样品体内细菌的检测，发现两者的肝胰脏和肠道均有大量的细菌，但两者细菌的数量和种类有显著的差异。正常组对虾肝胰脏的可培养细菌密度范围为1.59×106～5.83×106cfu·g-1，平均3.18×106cfu·g-1；弧菌密度为1.46×105～2.99×105cfu·g-1，平均1.97×105cfu·g-1，占可培养细菌的7.64%；在TCBS培养平板上观察，黄色弧菌占绝对优势，密度范围为1.20×105～2.86×105cfu·g-1；绿色弧菌的密度范围为0.6×104～3.9×104cfu·g-1，黄色弧菌的密度是绿色弧菌密度的10.25倍，其中的一株黄色弧菌为绝对优势菌株。
 
　　患病对虾肝胰脏的可培养细菌密度为2.87×106～8.24×107cfu·g-1，平均2.71×107 cfu·g-1；弧菌密度为1.28×106～3.59×106cfu·g-1，平均1.87×106cfu·g-1，是正常对虾组的9.5倍，弧菌占可培养细菌的15.89%；在TCBS培养平板上观察，绿色弧菌占绝对优势，密度范围为1.02×106～2.97×106cfu·g-1，平均1.42×106cfu·g-1，黄色弧菌的密度为0.2×106～0.63×106cfu·g-1，绿色弧菌密度是黄色弧菌密度的3.16倍，其中的一株绿色弧菌为绝对优势菌株。
 
　　两株优势菌株均为革兰氏阴性菌，菌体为弯杆状，无芽孢，对弧菌抑制剂O/129均敏感，发酵葡萄糖产酸不产气，生长需NaCl，可利用D-甘露醇，在TCBS平板上分别形成黄色和绿色的圆形菌落，具有弧菌属的典型特征。
 
　　今年3月，Chalor教授向拜耳（四川）动物保健有限公司的刘涛博士介绍，他们在泰国和其它地区也发现病虾的肝胰脏内有大量的细菌存在。他还向记者透露，Lightner教授最近发现了一些有趣的现象，在越南的一些区域，他们在“早期死亡综合症”病虾体内分离出一些细菌，目前还在研究试验当中，看是否就是这些细菌导致对虾的“早期死亡综合症”。
 
　　1.4  两株弧菌优势菌株对南美白对虾的人工感染
 
我们从患病对虾的肝胰脏分离出一株弧菌优势菌株，在TCBS培养基上其菌斑的颜色呈绿色；正常对虾的弧菌优势菌株则是一株黄色弧菌，在TCBS培养基上其菌斑的颜色呈黄色。在实验室条件下，分别用两株弧菌优势菌株以不同的密度梯度接种到水族箱对健康的南美白对虾幼虾进行人工感染试验。实验结果表明：没有接种任何菌株的对照组的对虾摄食生长正常，实验结束时，水体和对虾肝胰脏内均检出少量的黄色弧菌，但未检出绿色弧菌；在接种绿色弧菌的试验组中，只要水中绿色弧菌的接种密度达到0.5×104cfu·mL-1时，水族箱的对虾从接种的第3天开始出现死亡，10天内的累计死亡率达到72%；当接种密度为2.5×104cfu·mL-1时，10天内的累计死亡率达到98%。死亡对虾的外表症状与“早期死亡综合症”基本一致，出现肝胰脏肿大、颜色淡黄、失去食欲、空肠空胃等典型症状，并从死亡幼虾的肝胰脏检测到大量的绿色弧菌和少量的黄色弧菌；在接种黄色弧菌的试验组中，试验期间幼虾摄食生长基本正常，仅有少量幼虾死亡，10天内的累计死亡率为15.5%～22%，死亡幼虾没有“早期死亡综合症”的典型症状，实验结束时，在养殖水体和幼虾的肝胰脏中均检出大量的黄色弧菌，但未检出绿色弧菌。实验结果表明，两株弧菌优势菌株在养殖水体中均可经口感染对虾的消化器官，有很强的感染能力，并可在对虾的消化器官中定植并生长繁殖。通过比较两组对虾的累计死亡率，笔者认为绿色弧菌比黄色弧菌具有更强的毒力。本次人工感染试验是在实验室的条件下进行，由于受光照的限制，养殖水体中没有藻类，说明在没有藻类存在情况下，对虾同样会出现“早期死亡综合症”的症状；本次实验设置的绿色弧菌最小接种密度为5.0×103cfu·mL-1，10天内幼虾的累计死亡率达到72%，绿色弧菌在南美白对虾养殖水体中的安全密度应少于5.0×103cfu·mL-1。
  
2“早期死亡综合症”的防控措施
　　
　　南美白对虾“早期死亡综合症”的发生除了与大量的弧菌感染有密切关系之外，也和养殖生态环境差、藻毒素的影响以及对虾自身体质虚弱等诸多因素有关。