鱼类对金属和类金属氧化应激反应研究进展

中国水产门户网报道   1 引言
   金属，特别是重金属，是世界各地水环境中重要的污染物之一。重金属污染程度的加深与人类的活动密切相关。工业、矿业、农业、交通等行业的生产活动被认为是重金属污染的主要来源。金属可以积聚在包括鱼类在内的水生生物体内，并且可以长期存在于水底的淤泥等沉积物中。鱼类食品是人类营养的重要来源之一，因此水生生物的金属污染对人类健康存有潜在的风险。重金属能够诱导氧化应激，研究鱼类的氧化损伤及其抗氧化防御系统对了解水生环境的金属污染有着重要意义。金属的形态、溶解度及其络合是影响水生环境中金属毒性的重要因素。金属的溶解量在很大程度上取决于水的 pH 值。金属的相互作用能够改变它们对水生生物的毒性作用。接触金属的不同方式对金属毒性作用的发挥也起着重要作用。鱼类可以通过鳃、消化道或者体表接触到金属。有多种金属离子同鱼类的氧化应激有关。本文主要介绍最重要、近年来研究最多的几种金属(铁，铜，铬，汞和铅) 以及类金属元素(砷，硒) 同鱼类氧化应激的关系。
   2 氧化应激和抗氧化防御系统
    氧化应激反应是有氧生物不可避免的。它是生物体的活性氧簇( reactive oxygen species，ROS)和抗氧化防御系统之间不平衡的结果。ROS是过渡金属离子、农药、石油污染物等物质诱导产生的。自由基是正常细胞新陈代谢过程中由内源性细胞产生的。线粒体呼吸是 ROS 主要的内源性来源。ROS 的逐步产生可以导致蛋白质和脂质的氧化，基因表达的改变以及细胞氧化还原状态的变化。
    鱼类体内包括酶系统和低分子量的抗氧化剂在内的抗氧化防御机制同哺乳动物相似，不过鱼类各种酶的具体亚型尚未完全鉴别出来。超氧化物歧化酶( superoxide dismutase，SOD) ，过氧化氢酶( catalase，CAT) ，谷胱甘肽过氧化物酶( glutathione peroxidase，GPX) 和谷胱甘肽-S-转移酶( glutathione-s-transferase，GST) 是主要的抗氧化酶，也是氧化应激的重要指示物。还原型谷胱甘肽( glutathione，GSH) 和氧化型谷胱甘肽二硫化物( glutathione disulphide，GSSG) 则在非酶抗氧化防御中发挥关键作用。
     金属结合蛋白，如铁、铜蓝蛋白和金属硫蛋白( metallothioneins，MTS) 对有毒金属具有解毒的特殊功能，在金属代谢和动态平衡中也起着重要作用。金属硫蛋白是富含半胱氨酸残基的低分子量蛋白质，可以结合各种金属，包括汞、银、铜、镉、铅、锌和钴等。有报道称，不同种类的鱼具有不同的金属硫蛋白亚型。金属硫蛋白参与必需金属(如铜和锌) 的调控以及非必需金属的解毒功能。锌对金属调节转录因子具有激活作用，可以引导 MT 基因的表达。
     3 金属诱导氧化损伤的机制
     金属参与的氧化损伤是多方面的。在一般情况下，金属产生自由基的主要方式有两种。具有氧化还原活性的金属，如铁、铜、铬、钒等通过氧化还原循环产生 ROS。无氧化还原电位的金属，如汞、镍、铅和镉等直接损害抗氧化防御系统。自由基产生的第三个重要机制是 Fenton 反应。通过这一反应，亚铁离子被氧化为铁离子，产生羟基自由基和羟基负离子。而超氧自由基则可以减少铁离子成为亚铁离子形式。铜、铬、钒、钛、钴及其复合物也可参与 Fenton 反应。具有氧化还原敏感性的转录因子如 AP-1、P53 和 NF-κB 的激活是金属参与产生氧化应激的另一种机制。这些转录因子控制修复 DNA 保护性基因的表达，影响细胞的凋亡、分化及其生长。
     4 同鱼类氧化应激反应有关的金属
     4． 1 具有氧化还原活性的金属
     4． 1． 1 铁
     铁是许多生理功能发挥所需的一种重要元素，其动态平衡由各种机制严格调控。在生物体内，大部分铁是同血红蛋白、转铁蛋白和含铁酶结合在一起的。因此，只有极微量的游离铁存在于生物体内。铁摄入过量或者铁的调控受到干扰后能够引起毒性，这同通过 Fenton 反应催化 ROS的能力有关。铁还具有增强百草枯或 2，3，7，8-四氯二苯并-P-二恶英等化学物质毒性的作用。异生物质释放出的结合铁能使其产生自由基。由于铁和超氧化物的新陈代谢是相互关联的，因此各种能够产生超氧化自由基的物质可以诱导铁的氧化能力。
     铁的有害作用包括 DNA 损伤、脂质过氧化( lipid peroxidation，LPO) 和蛋白质的氧化等。
有实验报道，将成年青鳉( Oryzias latipes) 以及青鳉胚胎暴露于纳米铁中，结果出现了脂质过氧化以及抗氧化酶活性的改变。胚胎实验结果显示，SOD 活性的抑制以及丙二醛产生的增加同铁的剂量呈正相关。成年青鳉接触到铁之后，起初肝脏和脑的 SOD 活性降低，但随着接触时间的增加，活性又增强了。迄今尚无证据表明成年鱼存在氧化损伤，因此，这项研究仅表明接触到纳米铁后青鳉胚胎比成年青鳉更为敏感。还有一项研究称，给一种非洲鲶鱼( Clarias gariepinus) 饲喂铁含量丰富的饲料后可以引起肝和心脏的脂质过氧化。2008 年的一个报道称，在一条重金属污染较为严重的河流中，发现慈鲷红细胞中 SOD 的活性显著增强，且 LPO 的水平也很高，其中，春天时的水平最高，因为此时该河流中铁的浓度也最高。还有报道称，金鱼( Carassius auratus) 在含有硫酸亚铁的水环境中生活后，其肝脏和肾脏的蛋白质羰基数增加，这是蛋白质氧化的重要标志之一。
    4． 1． 2 铜
    铜在生物的多种代谢过程中起着至关重要的作用。它是包括铜—锌超氧化物歧化酶、细胞色素氧化酶和铜蓝蛋白在内的许多酶和结构蛋白的重要组成部分之一。铜天然存在于土壤和水中，矿业、工业污水的排放，含铜的农药，特别是杀藻剂，是水污染的重要来源。铜对于鱼类的毒性以及在水中的生物利用率同水的各种理化性质有关，如 pH 值、碱度、悬浮物、有机化合物的含量以及硬度等。游离铜以及铜离子的浓度随着水体酸度的增加而增加。水的 pH 值在 8．0 及以上时，氢氧化铜在水中占主导地位。与水的硬度有关的钙也可以减少铜对罗非鱼生长的有害影响。铜的细胞毒性可以通过它参与 Fenton 反应来解释。亚铜离子可以催化羟基自由基的形成。铜诱导产生的氧化损伤可以被多种物质增强。欧洲鳗鱼( Anguilla anguilla) 暴露于 β-萘黄酮( BNF) 后能够引起与铜有关的 LPO 的增加以及 DNA 损伤。这项研究表明，铜和 BNF 之间存在一种协同关系。BNF 可以增加肝脏中乙氧基香豆素-O-脱乙基酶( ECD) 的活性，引起铜减少。这种机制有利于铜的氧化还原循环，导致ROS 的水平提高。铜能结合含巯基的分子的物质，如谷胱甘肽( GSH) 。三刺鱼( Gasterosteus aculeatus) 暴露于硫酸铜后可以观察到肝中的 GSH受到抑制。也有报道称，暴露于硫酸铜后可以导致鱼类肌肉中的 GSH 被耗尽。
     铜对各种异生物质引起的氧化损伤具有保护作用。铜蓝蛋白和金属硫蛋白的抗氧化作用
     是铜具有保护机制的重要原因。铜蓝蛋白可以作为血浆中的铜转运蛋白。有报道称，暴露于铜之后可以引起鱼血清中铜蓝蛋白活性的增强。铜蓝蛋白具有亚铁氧化酶活性，可以作为血浆中的抗氧化剂。铜能诱导金属硫蛋白的生物合成。有报道称，纹鳢( Channa punctatus) 长期暴露于铜后，金属硫蛋白可以对其起重要的氧化防御作用。
     4． 1． 3 铬
     铬化合物常用于铬铁生产、电镀、颜料生产、制革等。这些工业生产以及矿物燃料的燃烧、废物燃烧是引起水和空气铬污染的重要原因，铬在自然界也是普遍存在的。铬重要的氧化态是三价以及六价的铬。有报道称，大鳞大马哈鱼( Oncorhynchus tschawytscha) 长期暴露于含有六价铬的水环境中，可以观察到 DNA 损伤以及 LPO 水平的逐渐提高。报道的作者认为六价铬在肾脏中的聚集导致鲑鱼在微观以及宏观上出现很多异常，对鲑鱼的生长以及存活产生负面影响。
黑头软口鲦( Pimephalus promelas) 和大口黑鲈( Micropterus salmoides) 暴露于含六价铬的水中或者摄入含铬的饲料后，可以观察到其红细胞中的DNA -蛋白交联的现象。这也说明铬对于鱼类的影响主要是改变 DNA 的氧化诱导作用。
     4． 2 不具有氧化还原活性的金属以及类金属
     4． 2． 1 镉
     镉是一种非必需金属元素，水环境中的镉主要来源于工业活动。镉不能直接产生 ROS，但可以改变 GSH 的含量，影响细胞巯基的状态，诱导肝脏中金属硫蛋白的表达。GSH 和 MT 的变化可以引起细胞膜脂质的过氧化。镉进入线粒体的电子传递链后，导致能够给出电子的辅酶含量的增加，产生超氧化自由基。镉也能够影响抗氧化酶的活性，尤其是 SOD 和 CAT，能够在各种蛋白质中取代铜和铁，使这些金属游离，然后参与 Fenton 反应。有报道称，暴露于镉后，舌齿鲈( Dicentrarchus labrax) 肾脏的 CAT 活性降低，活性降低与 CAT 的直接结合有关。金属硫蛋白对镉的解毒起着主要作用，但这个过程是器官特异性的。已有不少研究报道，镉暴露之后，可以诱导 MT 的从头合成。镉暴露后对 GSH含量的影响因鱼的种类，接触时间以及所涉及的化学物质的不同而有所不同。不同的实验条件下，GSH 的含量水平有可能上升，也可能下降。
     4． 2． 2 汞
     汞是一种重要的全球性水污染物。各种人类活动( 如白银和黄金开采、煤炭燃烧、牙科用汞合金等) 与汞污染有关。汞在自然界中主要以甲基汞或无机汞的形式出现。甲基汞对鱼类的毒性要大于无机汞。汞可以与 GSH 的巯基反应，导致组织中 GSH 耗竭，引起氧化应激。很多研究表明，有机和无机汞都能够参与 ROS 的形成。MT 对于汞暴露也有保护作用。有学者从生活在汞污染河流中的鲤( Cyprinus carpio) 肝脏中发现了两个 mRNA 表达的 MT 基因。但是实验并不能证实这两个基因同鱼的组织氧化损伤有关。有研究报道称，亚马逊石脂鲤( Brycon amazonicus) 暴露于无机汞 96 h 以后，包括 SOD、CAT、GST、GPX 以及 GR 在内的多种抗氧化酶的表达发生了改变，导致蛋白质及脂质的氧化。
    4． 2． 3 铅
     铅是一种主要的环境污染物。油漆、化妆品、人类药品、食品添加剂和以石油为基础的燃料是铅污染的来源。铅在沉积物中的积累对水生生物具有重要意义。铅可以通过对细胞膜的直接作用，诱导氧化损伤，铅和血红蛋白之间的相互作用可以引起血红蛋白自动氧化的增强，或通过与硒形成复合物削弱 GPX 的活性。有实验报道，往腋孔蟾鱼( Halobatrachus didactylus) 腹腔注射一定剂量的铅之后，MT 的含量水平增加了，说明铅能够诱导 MT 的合成。研究还发现，铅并不能较好地诱导 LPO，因为肝脏中丙二醛的水平降低了。也有报道称，蟾胡子鲇( Clarias batrachus)暴露于含铅的水环境中后，体内丙二醛的含量水平逐渐上升。这说明铅诱导的氧化应激跟暴露持续的时间有关。
     4． 2． 4 砷
    砷是一种人类已知的致癌物质。自然界中，砷以无机以及有机复合物两种形式存在。谷胱甘肽对砷诱导的细胞内氧化还原起着关键作用。砷在细胞代谢过程中可以产生 ROS。不少研究报道了 GSH 在砷中毒中所起的作用。有学者指出，砷对斑马鱼( Danio rerio) 肝脏细胞系产生毒性作用的可能机制是由氧化应激诱导的细胞凋亡。砷甜菜碱( arsenobetaine) 和砷胆碱( arsenocholine) 是存在于鱼体内的主要无毒性的有机形式。
    4． 2． 5 硒
    硒是具有抗氧化防御作用的基本元素之一，是 GPX 的一个辅助因子。虹鳟( Oncorhynchus mykiss) 遭受重金属诱导的应激作用后，硒对此有重要的保护作用。但是，高剂量的硒具有毒性。硒主要存在于富含硒的煤炭中，硒酸盐是硒的主要存在形式。水体中的硒主要来源于富含硒的工业废弃物的排放，累积到一定量之后便具有了毒性。植物具有将硒转化为硒酸盐或有机硒的功能。硒引起毒性的一个重要机制是产生ROS。
     4． 2． 6 其他金属
     除了上面提到的金属和类金属外，其他一些金属，如镍，钒，钴也同氧化应激有关，它们也可以在水体中被检测到。三丁基锡和铝也是普遍存在的污染物，它们对鱼的毒性在诱导氧化应激中也可能发挥着一定的作用，但需要进行更多的研究来探讨这种可能性。