蛭弧菌及其在水产养殖业的应用

中国水产门户网报道     蛭弧菌的生物学名称为噬菌蛭弧菌。蛭弧菌是一类专门捕食细菌的寄生性细菌，具有独特的裂解细菌的生物学特性，能够在较短的时间内裂解水体中的沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shiglla)、这形杆菌属(Proteus)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwina)、弧菌属(Vibri)等属的种类，可将致病菌限制在较低水平上，同时还可有效地控制养殖水体的COD、硫化物和氨氮存留量，因此，利用其这一特性作为水产养殖水体的生物化物和“活性抗生素”具有广泛的发展前景，对开拓水产养殖动物疾病防治新途径具有重要意义。

    一．蛭弧菌的生物学

    (一)蛭弧菌的分布与分类
    国外学者Setlp和Pong分别从土壤中分离到蛭弧菌；Schoeffielda和Williams、呼兰、崔思列、马志宏等人也分别从海水、河水、人粪便及污水中发现有蛭弧菌。张宗诚、余倩等等人对成才地区蛭弧菌的分布及数量进行了调查，发现蛭弧菌普遍存在，且指出蛭弧菌的数量主要与立体的温度和受污染程度有关。上述研究证明蛭弧菌普遍存在和广泛的分布状态，这为蛭弧菌的分离提取提供了可能。
蛭弧菌的分类在伯杰氏(B ergey’s)细菌鉴定手册中提到，属于薄壁菌属、共有四种：噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriouorus简称Bd菌)、斯托普弧菌(Bd．stolpii)、斯塔尔蛭弧菌(Bd．starrii)和一种未命名的海水菌株。
    
    (二)蛭弧菌的形态特征
    蛭弧菌具有一般细菌的特性，较一般细菌小，能通过过滤器，有类似噬菌体的作用。革兰氏染色阴性，单细胞，呈弧状或杆状，大小为(0.3～0.6)u m×(0.8～1.2)u m，或仅为杆菌长度的l／3～l／4。胞浆中常可观察到致密小体，长约150nm～300nm，宽为70nm～120nm，呈片状结构。核区非常明显，周围包绕着数个核糖体颗粒。在蛭弧菌中还可以见到间体及其他许多内含物质，端生鞭毛，多为l根。有的在另一端生有一束纤毛。水生蛭弧菌的鞭毛还具有鞘膜，是细胞壁的延伸物，并乌黑有鞭毛丝状体，故比其它细菌的鞭毛粗3倍～4倍。蛭弧菌的鞭毛基部没有类似于其它革兰氏阴性鞭毛基部所具有的L环结构。细胞中蛋白质量可占干重的60％～65％，DNA含量5％，从自然界分离的都呈依赖寄生型，与宿主细胞间常表现出一定的特异性，但有的特异性较差，能侵入多种细菌。
普遍证实蛭弧菌在适宜宿主上形成噬菌斑的pH为5.5～9.0，最适pH为7～8。蛭弧菌对热敏感，50℃以上时，30分钟失去活性；40℃时30分钟活性减少一半。在4℃～37℃条件下都有可生长，最适生长温度为25℃~30℃，为一类嗜中温性细菌。蛭弧菌在死菌中形成噬菌斑数是活菌的35倍～290倍。

    (三)蛭弧菌的宿主
    l 999年，杨淑专等人研究了海洋蛭弧菌对对虾病原菌和其他寄主的寄生作用，表明蛭弧菌不仅对各种弧菌、气单胞菌、邻单胞菌都有裂解作用，且对非海洋细菌如大肠杆、绿脓杆菌也有裂解作用，甚至对革兰氏阳性菌如枯草杆菌和金色葡萄球菌也能裂解。
蛭弧菌对鱼类常见致病菌裂解作用及对鲤鱼嗜水气单胞菌预防效果的研究也进一步证明了蛭弧菌对致病菌的裂解能力明显大于非致病菌，且肠道病病原菌更易裂解。Pineiro等人对蛭弧菌的宿主范围进行了研究，已证实蛭弧菌对沙门氏菌属、志贺氏菌属、这形杆菌属、埃希氏菌属、欧文氏菌属、弧菌属中的众多种类均有很强的裂解能力。

    (四)蛭弧菌的生活周期与生活史
国外学者对蛭弧菌的生活周期作了大量研究工作，尤其是近几年又从微观水平上对蛭弧菌的生活周期开展了大量研究工作，如Nunez等人利用原子力显微镜观察研究了蛭弧菌109J的生活周期；Rendulic等人从基因水平上对蛭弧菌的生活周期进行了研究；Beck、Barel等人研究发表了蛭弧菌宿主体内增长时产生在蛋白等。Thomashow等提出了。蛭弧菌的穿入、稳定、裂解”模型，即首先蛭弧菌通过化学趋避性识别，并吸附宿主细菌，然后通过酶解和机械钻孔等一系列反应，进入宿主细菌的质壁空间或细胞质，对宿主细胞进行一系列的修饰与改造，同时进行自身生物大分子合成，最终分裂形成子代蛭弧菌并释放到宿主细胞外。
    蛭弧菌为细胞内寄生物，整个生活周期可分为识别、侵入、穿入宿主菌体、生长发育、裂解宿主、释放子代蛭弧菌。
    蛭弧菌的生长过程可分为两个时期：具有1根有外鞘的极生鞭毛和高度的运动性的攻击期扩鞭毛脱落，不具有运动性的生长周期。攻击期时，其与宿主菌激烈碰撞，以没有鞭毛的一端直接吸附到宿主细菌上，菌体转动速度超过200r／s，在此之后，鞭毛脱落，然后释放出多种酶以穿透宿主细胞壁的小孔右进入到细胞内，和细胞膜之间或直接进入细胞间质中。侵入过程仅几秒钟。穿入宿主菌后，鞭千周消失，整个过程最长为60分钟。宿主菌则因渗透压改变而涨大成圆球状，且立即死亡，面为蛭弧菌的生长空间。它利用宿一的原生质为养分生长，经过一定时间后，宿主营养被完全吸收，长螺旋状的菌体均等二分裂出许多带鞭毛的子代，它们可以重新浸染宿主，开始下一个循环过程。完成这一增殖的全过程约需4小时～6小时。在饥饿等特殊情况下，蛭弧菌会进入囊体周期。

    (五)蛭弧菌的生态学特点
    蛭弧菌在自然界的分布较广，其含量通常在夏季较高，而在冬季较低。土壤、植物根际、河水、海水、湖水、井水及下水道污水中都有蛭弧菌的分布，并能从陆生动物、水生动物或人的粪便中分离到蛭弧菌。但在清洁的自来水、泉水中很难检出。水生蛭弧菌属倾向于表面生长，是生物膜的重要组成成分。

    (六)蛭弧菌的保藏
    蛭弧菌的保藏关系到其规模化生产和应用。国外的研究表明，用含宿主细胞的YP培养基保藏蛭弧菌，在4个～8个月内仍有一定活性。国内的研究表明，在4℃条件下，用自来水宿主软琼脂保藏时，至少可存活3个月以上；黄文等人用4℃甘油、4℃NB液、平板、-20℃甘油和冷冻干燥等5种方法保蒇蛭弧菌，发现冷冻干燥法最好，21个月的复洗率达100％，且复活后的形状和噬菌特性不变；其次为-20℃甘油NB液保存法，17全月的复活率为67％；其它方法的保存时间也平均超过3个月。

    (七)蛭弧菌的噬菌条件
    大量研究表明，蛭弧菌对pH、温度等环境因子的要求并不严格。邵桂元等人作了鱼病蛭弧菌的微生态学初步研究，发现蛭弧菌Bds-4等菌株在4℃～37℃和pH6.0～8.0的条件下。对点状产气单胞菌有形成噬菌斑的能力。李戈强等人经研究指出，蛭弧菌在温度10℃～35℃和pH6.5～8.1的范围内，对河流蛭弧菌均有裂解作用；在25℃～30℃和pH6.5～8.1时的裂解作用最强。马志宏等人也经过研究认为蛭弧菌对环境条件的适应性强，对温度和PH的适应范围较广。

    (八)蛭弧菌的除菌效果
    秦生巨等人的研究认为，蛭弧菌在河水中21天后，可使不凝集弧菌由4.46×106个／mL降到27个／mL。杨莉等人的研究结果发现，蛭弧菌对鲤鱼感染嗜水气单胞菌的裂解效果，蛭弧菌在5天后使嗜水气单胞菌的浓度下降了103cfu／mL，9天后下降了107cfu／mL。说明蛭弧菌的除菌效率高。

    (九)蛭弧菌的安全性
    迄今为止，已有一些报道说蛭弧菌对人和某些动物无害。薛恒平、秦生巨等人曾报道蛭弧菌能够促进仔鸡生长，提高增重率；冯晓英等的研究表明，在注射0.02mL浓度为8×105pfu／mL的蛭弧菌后，观察72小时，实验小鼠全部存活，无任何病态，生长良好；Byrd等人也认为，蛭弧菌对人无致病性。但蛭弧菌对水产动物的安全性尚未进行更多的研究。

    二、蛭弧菌的科研现状

    (一)国外的研究
    自1962年stolp和Petzlod首次研究蛭弧菌以来，国外学者对蛭弧菌的生态学和生物学特性等已开展了大量研究。Shilo等人于1965年就对蛭菌的形态学展开了研究；其后的Starr等人在蛭弧菌分子生物科学家特性方面进行了研究；最近的Lambert、Martin、Nunez、Rendulic等人在蛭弧菌的裂解机制及其生活周期的动力学方面取得重大研究进展。
    国外学者的主要研究方向有：蛭弧菌基因及相关蛋白在生活周期中特性与功能，如淀粉酶基因、cya和类crp基因、MCP基因、丝氨酸蛋白酶和转运蛋白、外膜蛋白(OMPS)。蛭弧菌种间变异的研究，如外膜蛋白(OMPS)、脂多糖(LPS)、16sDNA序列、细胞大小、形状、噬菌斑大小、生长能力、染色情况、对宿主的敏感性等。借助原子力显微镜对蛭弧菌109J裂解宿主世界语的动力学研究。环境因素对蛭弧菌存活周期的影响，如重金属镉、苯酚、尿素等。从分子水平对蛭弧菌进行鉴定的研究PCR引物的设计等。

    (二)国内的研究
    我国对蛭弧菌的研究起步较晚。1982年，司稚东等人开展了蛭弧菌的系统性研究，在生物学特性、培养保藏方法、生态学及污水净化等方面取得很多成果；此后大批科研工作者开展了相关研究：如吴承龙等人研究了蛭弧菌某些生物学特性——形态、对不同宿主菌的裂解活性等；秦生巨、黄文等人研究了蛭弧菌保藏方法——冷冻干燥法、4℃营养肉烫液保藏法、-20℃甘油保藏法；赵孝先等人研究了蛭弧菌在细胞匀浆中增殖——大肠杆菌、大豆根瘤菌(灭活)、枯草芽孢杆菌(灭活)、酵母菌(灭活)匀浆液培养蛭弧菌；邵桂元等人研究了蛭弧菌最适培养条件——温度、pH等；杨淑专、李戈强、马志宏、杨莉等人分别研究了蛭弧菌对虾类致病菌——肠型点状气单胞菌、荧光假单胞菌、鳗弧菌等的裂解作用，用注射注解和浸泡感染方式研究蛭弧菌对欧洲鳗细菌性疾病的防治及其水质指标——pH、总硬度、浊度、生物耗氧量等。这些研究为蛭弧菌在水产养殖病害防治中的应用奠定了重要理论基础。
    但到目前为止，尚有一些问题有待进一步研究。一是蛭弧菌的噬菌机制尚未阐明。二是蛭弧菌生态学研究不够深入。三是蛭弧菌长效稳定的保藏方法不够全面。四是缺乏水体污染物对蛭弧菌影响的研究。五是缺乏蛭弧菌合理使用或测水施用的研究。六是有待研究高效专一的蛭弧菌及其制剂。七是有待加强蛭弧菌制剂的新剂型等。

    三、蛭弧菌的发晨前景

    目前，蛭弧菌已在我国商品化生产，并在水产养殖业中广泛应用。其主要生产单位和产品有：宝来利来(泰安)兽药饲料公司的淡水水产动物专用噬菌26(噬菌蛭弧菌溶液)，广东省新的生物工程研究所有限公司的复合噬菌蛭弧菌，南京(香港)威力克生物有限公司的鱼虾宝、蟹宝、鳝宝、蛙宝、鳗鱼宝、虾宝，南京福润德动物药业有限公司的三联噬菌皇(水产动物专用)，SPSinc．燕金科技发展有限公司的百得菌、噬菌蛭弧菌多株冻干粉型活菌制剂，江苏省海洋水产研究所的克菌1号——噬菌蛭弧菌生态制剂，南京行安科贸有限公司的解毒养水宝，北海兰大生物科技公司的鱼虾神等。
    蛭弧菌在水产养殖业中应用前景十分广阔。主要用途有：一是蛭弧菌是我国水产养殖动物病害生物防治的一种新工具，利用蛭弧菌控制和减少池塘中细菌性疾病发生。二是蛭弧菌是水产养殖水体的生物改良剂，利用蛭弧菌对水体中细菌的裂解作用，去除有害于水产养殖动物的致病菌，降低氨氮含量，改善养殖水体环境，减少鱼病的发生。与光合细菌合用，还有控制养殖水体的COD、硫化物等作用。三是蛭弧菌是细菌性疾病防治的“活性抗生素”，因为蛭弧菌能裂解一些异养细菌，使养殖水体中的水产养殖动物致病菌浓度大大降低，进而降低了细菌性疾病的发生率。

    四、蛭弧菌在水产养殖业上的应用

   目前，国内外关于蛭弧菌在水产养殖业上的应用研究多侧重于对环境水体的净化和水产养殖动物细菌性疾病防治两个方面。

   (一)水体净化
    秦生巨等人(1991)在自然河水中加入2.6×103cfu／mL噬菌蛭弧菌Bd81，并观察水质的变化情况，在48天的观察期间，水质的温度与细菌总数明显下降，而蛭弧菌的含量增加2倍～7倍，其它理化指标亦有所改变。王丽娜等人(1994)发现蛭弧菌的含量常后于水体污染，并且污染后，蛭弧菌可以在较长时间内维持高水平。一特性可以指示水体污染的新旧及是否遭到连续污染。余倩等人(1994)对成都市的5条主要河流中的噬菌蛭弧菌进行了调查，发现蛭弧菌普遍存在，且噬菌蛭弧菌的含量与污染程度有关，污染越严重则含量越高。

    (二)疾病防治
    何义进等人对加入蛭弧菌的试验组与未加入蛭弧菌的对照组进行比较后，发现试验组成活率比对照组高19.4％～15.5％，未发生爆发性细菌性鳗病。杨莉等人(2000)用不同浓度的蛭弧菌投入于水族箱中，对鲤用泡法进行人工感染气单胞菌(Aeromonashydropila简称SC)试验，结果表明，蛭弧菌对嗜水气单胞菌有较强的裂解作用，对水体中氨氮有一定的降解作用，并对鲤鱼感染嗜水气单胞菌所致爆发性出血病有明显的预防作用。黄冬菊等人(2002)在试验中发现噬菌蛭弧菌对海水中的弧菌有强烈的捕杀清除作用。陈有长等人(2003)用有益微生物(光合细菌和蛭弧菌混合物)在中华绒螯蟹养殖中发现，试验组比对照组池塘中的细菌总数呈几何数量级下降，氨氮、硫化物含量及COD都明显减少，成活率分别提高了11.3％、13.5％和13.3％，并指出，使用噬菌蛭弧菌的浓度为107cfu／mL和光合细菌的浓度为109cfu／mL均为5mL／m3较为理想。
    曾地刚等人(2004)采用噬菌蛭弧菌预防和治疗斑点叉尾鮰细菌性败血病时试验，结果显示，在试验水体中同时加入噬菌蛭弧菌和嗜水气单胞菌，当水体中的噬菌蛭弧菌浓度达到105／mL以上时有预防效果。采用背部肌肉注射嗜水气单胞菌的方法，使斑点叉尾鱼回感染，然后在水体中加入噬菌蛭弧菌，结果是试验鱼全部死亡，说明噬菌蛭弧菌不能起到治疗斑点叉尾鱼回败血病的作用。
    徐琴等人(2006)将球形红假单胞菌、噬菌蛭弧菌及粘红酵母用于中国对虾幼体培育水体，试验结果表明。与对照组相比，试验组的成活率、变态指数、体长均匀增长率、酚氧化酶和超氧化物歧化酶活力均优于对照组。试验结束后，试验组比对照组的细菌总数降低了三个数量级，添加噬菌蛭弧菌的组在减少异养菌方面有较好效果。同时用鳗弧菌攻毒，在5天内，对照组的死亡率明显高于试验组，试验组免疫保护率为29.4％～58.5％，以噬菌蛭弧菌和球形红假单胞菌试验组最为显著，使用浓度以2×105cfu／mL为好。
    韩韫等人(2005)用从海洋中分离出来的4株蛭弧菌作为生物净化因子，对16株常见海产品潜在的食源性致病弧菌进行裂解试验，发现4株同时使用，可裂解15株弧菌，裂解率高达93.9％。

    (三)药物对蛭弧菌生长和吸附的影响
    恩诺沙星(Enrofloxacin简称EF)．是第三代喹诺酮类药物，已广泛用于我国水产动物细菌性疾病的防治。由于养殖生产者缺乏科学用药知识，在进行水产养殖病害防治用药时，往往超剂量使用恩诺沙星，势必会影响蛭弧菌的生存。为此，曹海鹏等人研究了恩诺沙星对晴纶弧菌生长及吸附的影响。研究结果表明，在固体培养条件下，恩诺沙星对蛭弧菌BDF-H16噬菌斑的产生具有抑制作用，而且随着恩诺沙星浓度的升高，抑制作用越大；在液体培养条件下，蛭弧菌BDF-H16的增殖浓度随着恩诺沙星浓度的增高而降低。但10ug／mL恩诺沙星并没有改变蛭弧菌的生长趋势；而当在液体培养基中添加沸石时，蛭弧菌的吸附量随恩诺沙星含量的增加而逐渐降低。

    (四)水质因子对蛭弧菌裂解嗜水气单胞菌的影响
    上海水产大学的钱云云和曹海鹏进行了“水质因子对蛭弧菌裂解嗜水气单胞菌的影响”研究，结果如下：
    1、温度：在温度为15℃～33℃条件下，蛭弧菌BDF-H16对嗜水气单胞菌均能裂解，最适裂解温度为28℃，低温不利于蛭弧菌对嗜水气单胞菌的裂解。
    2、pH：在pH5.5～9.0的条件下，蛭弧菌BDF-H16对嗜好水气单胞菌均能裂解，裂解活性最高的pH为7.0～7.5，而在pH5.5～6.5和pH8.5～9.0时的裂解活性相对较低。
    3、Ca2+：在Ca2+浓度0～5.0mmol／L范围内时，对蛭弧菌裂解嗜水气单胞菌具有一定促进作用，以Ca2+浓度为0.5mmol／L时的裂解活性最高，而当浓度达10.0mmol／L时，裂解活性开始下降。
    4、Mg2+：当Mg2+浓度在2～2.0mmol／L时，蛭弧菌对裂解除嗜好水气单胞菌具有一定促进作用，Mg2+浓度为0.5mmol／L时的裂解活性最高，当Mg2+浓度大于5.0mmol／L时，裂解活性开始降低。
    5、NH4+：NH4+浓度对蛭弧菌裂解嗜水气单胞菌具有一定影响，情况是随着NH4+浓度的升高，蛭弧菌BDF-H16对嗜水气单胞菌的裂解活性降低。当NH4+浓度在0.2mg／L时，产斑数目较对照组少23.0％而当NH4+浓度为0.8mg／L时，产斑数较对照组少64.7％。
    N02-：N02-对蛭弧菌裂解嗜好水气单胞菌也有一定影响。当N02-浓度在0.05mg／L～0.30mg／L时，对裂有一定促进作用，其中以浓度为0.30mg／L时的裂解活性最高，产斑数较对照组高1.6倍，但当浓度在0.5mg／L时，裂解活性开始下降，产斑数目降低为对照组的50.9％。

    (五)蛭弧菌对有益微生物的裂解作用
    上海水产大学的张书俊和曹海鹏还进行了蛭弧菌对有益微生物的裂解研究，利用水产养殖上常驻用的酵母菌、枯草芽孢杆菌、硝化细菌作为宿主，同时以嗜好水气单胞菌为对照，除宿主菌为硝化细菌的双层平板没能形成噬菌斑外，其余均有噬菌斑产生，但有益菌相对于嗜好水气单胞菌的出斑时间明显常后，说明蛭弧菌对致病菌的裂解能力强；水中裂解实验验证。8天后酵母菌数目的对数值较起始值下降了0.59，枯草芽孢杆菌数目的对数值下降1.1，而嗜水气单胞菌下降了2.8。说明蛭弧菌致病菌的能力比非致病菌强，但也能影响水体中的有益菌存在，因此，在筛选水产用蛭弧菌时，应尽量筛选出对有益菌无裂解作用的菌株，并以此为筛选标准。